[发明专利]用于核酸测序的方法和工具

摘要

经由合成的核酸测序。在重复的步骤组中引发互补于模板链的第二链的合成，每一步骤包括提供一种或多种可能的核苷酸互补性类型以用以掺入到合成链中，且每一步骤组包括提供所有四种可能的核苷酸互补性类型。可以首先提供四种可能的核苷酸互补性类型中的三种，以用以掺入到合成链中，然后单独地仅提供第四种核苷酸互补性类型。同样，由茎部及第一和第二环部组成的DNA分子及其用途，特别是在测序中的用途，其中所述茎部由第一链和第二链组成，其中所述第一链和第二链长度相等、互补且退火在一起，其中所述第一环部将所述第一链的3’端连于所述第二链的5’端，而所述第二环部将所述第二链的3’端连于所述第一链的5’端，从而所述DNA分子没有游离的5’或3’端。

主权项

1.确定核酸的序列和/或碱基组成信息的方法，所述方法包括：(i)提供包含第一链的核酸，所述第一链包含核酸模板，其中与所述第一链退火的核酸链的游离3’端允许互补于核酸模板的核酸链延伸，这是由模板依赖性的核酸聚合酶，通过模板序列依赖性地将核苷酸掺入到互补于核酸模板的核酸链中实现的；(ii)实施一组的一个或多个步骤，以期望的次数循环该组一个或多个步骤，或与其他组的一个或多个步骤联合实施，以延伸互补于核酸模板的核酸链，从而允许获得表示所述核酸的碱基组成或序列的信息，其中一个步骤包括：(a)在存在下述时：包含第一链的核酸，所述第一链包含核酸模板，与所述核酸模板的第一链退火的核酸链的游离3’端，和模板依赖性核酸聚合酶；提供选自一种、两种、三种或四种核苷酸互补性类型的核苷酸，以用于由所述核酸聚合酶将所述核苷酸模板依赖性地掺入到互补于核酸模板的核酸链中，其中每一种所述核苷酸是天然核苷酸或核苷酸类似物，它们能够在核酸链的游离3’端由核酸聚合酶模板依赖性地掺入到核酸链中，且在每一种核苷酸互补性类型内，所述核苷酸和核苷酸类似物与腺苷(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)之一互补；和(b)除去或灭活未掺入的核苷酸；且其中在一组步骤内提供选自所有四种核苷酸互补性类型的核苷酸，并且其可用于进行模板依赖性的掺入，在至少一个步骤中，提供选自超过一种、任选两种、三种或四种核苷酸互补性类型的核苷酸，并且其可用于进行模板依赖性的掺入，且至少一种核苷酸互补性类型中的核苷酸，若掺入到互补于核酸模板的核酸链中，则允许互补于核酸模板的核酸链进一步延伸，和任选地在超过一个步骤中不提供核苷酸互补性类型；和其中，若在一个步骤中提供选自所有四种互补性类型的核苷酸，则一种、两种或三种核苷酸互补性类型中的核苷酸，若掺入到互补于核酸模板的核酸链中，则防止互补于核酸模板和存在的所有拷贝的核酸链进一步延伸，如果存在多拷贝的话；(iii)实施多组所述步骤，循环所述的步骤组和/或与不同的步骤组联合实施所述的步骤组；(iv)确定至少一组步骤中掺入到互补于核酸模板的核酸链中的核苷酸的性质和/或量，这是通过确定每一组的至少一个步骤中掺入到互补于核酸模板的核酸链中的核苷酸的性质和/或量实现的，对所述组要确定所掺入的核苷酸的性质和/或量。