[发明专利]一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法

摘要

本发明公开了一种利用植物基因工程技术培育甘蔗抗逆新种质的方法。该法把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的植株(转基因植株)。所获得的转基因植株由于能够合成和积累高水平的海藻糖，并表现出很强的抗逆性，在逆境条件下其比对照生长得好，而且产量和含糖量均得到了较大幅度的提高。利用该法培育甘蔗抗逆新种质具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界条件影响等优点，其将加速我国甘蔗抗逆品种培育的进程，促进蔗糖业的发展，具有广阔的应用前景。

主权项

1、一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法，它包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因植物表达载体的构建及转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、抗逆材料的鉴定和筛选过程，其特征在于：(1)所述甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程是以优良甘蔗栽培种的幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用75％乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于22-28℃避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生；所述诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加有2，4-D0.8-1.2mg/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.5-6.0之间；(2)所述灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌的过程是从担子菌灰树花(Grifola frondosa)的菌丝体中提取总RNA，并纯化出mRNA，再以mRNA为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增灰树花的海藻糖合酶基因的cDNA并进行测序，所得的片段即为灰树花的海藻糖合酶基因，之后把灰树花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表达载体pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体pBBBT，该基因由串联的双拷贝CaMV35S启动子和逆境诱导表达启动子Prd29A驱动，最后采用三亲交配法将其导入农杆菌EHA105中；(3)所述农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育是取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌EHA105单菌落接种到YEP液体培养基中，于25-28℃，200rpm振荡培养至OD600 为0.6-1.0后，离心回收细菌体，再重悬于等体积含100-300μmol/L AS的MR液体培养基中继续震荡培养1.5-2.5h，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化用工程菌液，之后把胚性愈伤组织转入处理好的农杆菌菌液中，侵染25-35min后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于MR固体培养基上于18-22℃黑暗条件下共培养4-6天，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化培养基上，于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导产生转化的胚状体，其间每10-15天在相同培养基中继代一次，长出的胚状体又转入抗性分化培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导产生抗性小植株，产生的抗性小植株再转接到抗性生根培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导生根并形成转化植株，获得的抗性植株再经过分子检测筛选出转基因植株；所述分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有KT1.0-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L，PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青霉素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之间；所述抗性分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有BA 0.5-2.0mg/L、KT 0.2-1.0mg/L、蔗糖25-35g/L，PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青霉素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之间；MR培养基是以1/5MS大量元素和MS其他成分为基础培养基，并添加有2，4-D 0.8-1.2mg/L、果糖8-12mmol/L、葡萄糖8-12mmol/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.0-5.8之间；所述抗性生根培养基是以MS为基础培养基，并添加有IAA0.5-2.0mg/L、PPT0.3-0.7mg/L、头孢霉素200-500mg/L，蔗糖15-25g/L，其PH在5.5-6.0之间；(4)所述抗逆材料的鉴定和筛选过程是把获得的转基因植株及相应的对照盆栽成活后分别在植物生长人工气候箱、大棚温室和大田进行逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆生理生化指标的测定，初步筛选出抗逆的转基因植株；对初选的抗逆转基因植株的无性繁殖后代继续进行植物生长人工气候箱、大棚温室和大田逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，测定抗逆生理生化指标再结合其性状的重组分离情况，采用Southern杂交、PCR扩增、Bialaphos或PPT抗性表现等鉴定转基因后代的遗传稳定性，进一步选出抗逆的转基因株系；对优选转基因株系进行干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆生理生化指标的测定，并在田间进行工农艺性状分析，最终评价转基因植株及其后代的抗逆性，筛选出抗逆的转基因甘蔗新种质。