[发明专利]转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法

摘要

本发明公开一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法。其检测方法为：1.DNA提取；2.DNA样品浓度检测；3.引物设计；4.第一、二轮三重巢式PCR反应体系及反应条件；5.扩增产物检测；6.结果计算和灵敏度分析。本发明提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。

主权项

1.一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法，其检测方法为：(1).DNA提取将大豆标准品粉末及其它待检样品根据WizardMagneticDNA Purification System for Food试剂盒操作说明分别进行DNA提取，并稍做改动；(2).DNA样品浓度检测DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定；(3).引物设计利用Primer Premier V5.0软件进行三重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物；引物所扩增目的片段及扩增产物大小为；(3-1)第一轮三重PCR所用引物引物名称：Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaactt Lec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag位置：Lectin内源基因外引物扩增片段大小：310引物名称：SC EF 序列(5′→3′)：gacgcacaatcccactatcc SC ER 序列(5′→3′)：ctgtagccactgatgctgaaa位置：35S启动子与CTP接合区域外引物扩增片段大小：357引物名称：EN EF 序列(5′→3′)：cgtgatgaacggtctggaa EN ER 序列(5′→3′)：caggcagccttcgtatcg位置：CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域外引物扩增片段大小：421(3-2)第二轮三重PCR所用引物引物名称：Lec EF 序列(5′→3′)：caagtcgtcgctgttgagt Lec IR 序列(5′→3′)：gtcgttttgatggatctgatag位置：Lectin内源基因内引物扩增片段大小：101引物名称：SC IF 序列(5′→3′)：cgcacaatcccactatcct SC IR 序列(5′→3′)：agcttgtcagcgtgtcctc位置：35S启动子与CTP接合区域内引物扩增片段大小：82引物名称：EN IF 序列(5′→3′)：aaaaccctgtcacggtgga EN IR 序列(5′→3′)：caggcagccttcgtatcg位置：CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域内引物扩增片段大小：115(4).三重巢式PCR反应体系(4-1).第一轮三重PCR反应体系及反应条件在第一轮三重PCR反应体系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，补水至50μL；扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30个循环；最后65℃延伸10min；(4-2).第二轮三重PCR反应体系及反应条件取第一轮多重PCR产物1μL作为模板，进行三重巢式PCR第二轮扩增；反应体系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前；扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38个循环；最后65℃延伸5min；(5).扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测；琼脂糖胶浓度为3％，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳缓冲液为1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000 DNA做分子质量标准，电泳条件为以10V/cm电压，电泳1h；(6).结果(6-1)DNA提取所选材料均是大豆深加工产品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒可以满足三重巢式PCR扩增的需要，但实际测量所提取DNA样品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280 也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带，说明所提取DNA样品浓度很低；(6-2)第一轮扩增结果第一轮扩增结果，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果；阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp；阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染；(6-3)第二轮扩增结果第二轮扩增结果，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp；卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带；(6-4)外引物扩增灵敏度分析第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％；(6-5)内引物扩增灵敏度分析第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。