[发明专利]一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

摘要

本发明涉及一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明设计了5对简并引物(共6条)用于快速扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因。本发明设计的5对简并引物序列为：引物1，AARTAYATYGTCAAGYWSAAG/AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物2，AARTAYATYGTCGTCYWSAAG/AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物3，AARTAYATYGTCGTCYWSAAG/TTAAGYRKHKCCRTTGWAG；引物4，MAWGMTKWYGAACSKYCT/GTRTCRATGACGTAGACKG；引物5，MAWGMTKWYGAACSKYCT/TTAAGYRKHKCCRTTGWAG。本发明以捕食线虫真菌基因组DNA作为模板，通过以上引物快速扩增胞外蛋白酶的编码基因。本发明能够快速扩增捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因，具有良好的应用前景。

主权项

1、一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法，包括真菌培养、真菌基因组DNA的提取、用引物进行PCR扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用引物由下列方法设计得到：(1)选择GenBank上发表的下列真菌和胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因用于简并引物设计；真菌名称 蛋白酶性质 GenBank索引 号Arthrobotrys 表皮降解丝氨酸蛋 X94121oligospora 白酶(PII)Arthrobotrys 中性丝氨酸蛋白酶 AF516146oligospora (Aozl)Paecilomyces 丝氨酸蛋白酶(Pr) L29262lilacinus Verticillium 碱性丝氨酸蛋白酶 AJ427460chlamydosporium (VCP1)Beauveria 表皮降解丝氨酸蛋 AF154118bassiana 白酶(Pr)Metarhizium 丝氨酸蛋白酶 AJ251925anisopliae (PrA)Cordyceps 表皮降解蛋白酶 AY520815brongniartii (Pr1)Fusarium sp. 碱性蛋白酶 S71812S-19-5 (Alp)Tritirachium 丝氨酸蛋白酶 X56116album(2)利用生物分析软件DNAman对上述真菌和胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因进行比对，并根据它们的保守序列设计出下列5对共6条简并引物： 上游引物序列 下游引物序列引 (5’--3’) (5’--3’)物1 AARTAYATYGTCAAGYWSAAG AYRTGDGGRSWRGCCATSGA2 AARTAYATYGTCGTCYWSAAG AYRTGDGGRSWRGCCATSGA3 AARTAYATYGTCGTCYWSAAG TTAAGYRKHKCCRTTGWAG4 MAWGMTKWYGAACSKYCT GTRTCRATGACGTAGACKG5 MAWGMTKWYGAACSKYCT TTAAGYRKHKCCRTTGWAG表中的简并碱基代码：M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。