[发明专利]百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应快速检测方法无效
申请号: | 200510010835.6 | 申请日: | 2005-06-03 |
公开(公告)号: | CN1873019A | 公开(公告)日: | 2006-12-06 |
发明(设计)人: | 王丽花;王继华;瞿素萍;杨秀梅;苏艳;张丽芳;陆琳;张璐萍 | 申请(专利权)人: | 云南省农业科学院 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12Q1/25 |
代理公司: | 昆明正原专利代理有限责任公司 | 代理人: | 徐玲菊 |
地址: | 65020*** | 国省代码: | 云南;53 |
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摘要: | 本发明涉及一种百合病毒的多重逆转录-聚合酶链反应快速检测方法,通过设计并合成百合潜隐病毒(LSV)、百合花叶斑驳病毒(LMoV)、百合黄瓜花叶病毒(CMV)全序列引物,并对三种引物的浓度、三重PCR扩增温度、扩增时间和循环次数等条件进行优化,把3对引物加入同一个反应体系,就能从病毒模板中分别扩增出这3种百合病毒条带,达到一次PCR扩增就可检测出此3种病原的目的,为生物技术领域的病毒检测方法开辟了一条准确、高效、快捷的新途径,同时有效降低了百合病毒检测成本,加快了检测速度,拓宽了检测深度及广度,实现了百合病毒分子多重快速检测的高效性、灵敏性和特异性。具有广阔的应用前景。 | ||
搜索关键词: | 百合 病毒 多重 逆转录 聚合 链式反应 快速 检测 方法 | ||
【主权项】:
1、一种百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应快速检测方法,包括引物设计、总RNA模板的制备、逆转录和cDNA合成、PCR扩增、扩增产物检测、结果判断,其特征在于:(1)、设计下列用于多重逆转录聚合酶链式反应的引物:LSVCP1-F:5’-ATGCAATCAAGACCAGCACA-3’LSVCP2-R:5’-TCATCCATTATTTGCGTATC-3’LMoV-F:5’-TGGGCACCTTGTGAATTACA-3’LMoV-R:5’-TGCTGTATGCCTCTCCGTGT-3’CMV-F:5’-CgTTCACATCTATCACCCTA-3’CMV-R:5’-TACTTTCTCATgTCgCCTAT-3’(2)、逆转录和cDNA合成在Eppendorf PCR管中,依次加入以下试剂:双蒸水ddH2O 8.0μL50~100pmol/μL互补引物 0.5μL总RNA 2.0μL70℃变性10min,冰上放置5min5×M-MLV逆转录缓冲液 4.0μL10~20mmol/L dNTPs 4.0μL40~80u/μL核糖核酸酶抑制剂 0.5μL100~200u/μL M-MLV逆转录酶 1.0μL将以上所有成分混匀,低速离心后,热循环仪中37℃反应1h,合成出cDNA,进行PCR扩增或保存于-20℃;(3)、PCR扩增依次在Eppendorf PCR管中加入以下试剂:双蒸水ddH2O 31.5μL10×PCR缓冲液 5.0μL10~20mmol/L dNTPs 2.0μL20~25pmol/μL LSV上游引物 1.0μL20~25pmol/μL LSV下游引物 1.0μL25~30pmol/μL LMoV上游引物 1.25μL25~30pmol/μL LMoV下游引物 1.25μL40~45pmol/μL CMV上游引物 0.5μL40~45pmol/μL CMV下游引物 0.5μL5~10u/μL rTaq聚合酶 1.0μL20~50ng cDNA 5.0μL总体积 50.0μL充分混匀,短暂低速离心后置于PCR仪中进行扩增,反应模式为递降式PCR,具体程序为:94~95℃预变性10min,前10个循环为94℃变性30s,退火30s,即每循环降1℃,从64℃降至54℃,72℃延伸60s,后20次循环为94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸60s,最后72℃延伸10min。
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