[发明专利]快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法

摘要

本发明提供一种快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，它通过检测甲肝病毒复制时出现的标志物负链RNA中间体来确定病毒的存在，突破了现有逆转录聚合酶链式反应不能区分感染性甲肝病毒和失活病毒的局限，同时克服了细胞培养法存在的步骤繁杂，耗时较长，常导致疫苗库存期长，缩短疫苗有效期等不足，使培养时间由一个月缩短至八天，大大缩短了检测周期，病毒培养过程中勿需替换维持液，降低了污染的机率，减少了常规方法中细胞后处理步骤如反复冻融、超声，降低工作量，有效提高工作效率，通过对聚合酶链式反应产物的测序提供病毒遗传信息。

主权项

1、一种快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，其特征在于包括下列步骤：A、病毒培养将KMB17细胞植入小方瓶中，培养至长成新鲜单层后，将甲肝减毒活疫苗样品作10倍系列稀释，取稀释度为10-4-10-9的病毒液接种至该细胞单层上，吸附1～2小时后，补加维持液，于35-37℃培养5-8天；B、提取细胞内甲肝病毒基因组正链RNA；C、引物设计正向引物N1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-GGATGTTTCAGGAGTACAAGC-3’反向引物N2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-CTCTGATTGTTCTGTGACAGAC-3’正向引物M1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-3’反向引物M2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-3’正向引物N3：5’-ATTACAGGAGCAACTGATGTAG-3’；D、检测甲肝病毒负链RNA中间体(1)、逆转录反应在离心管中依次加入下列试剂：10×逆转录缓冲液 2.5～5.0μldNTP混合物(2.5～10mmol/L) 1.25～10μl正向引物N1(5～60μmol/L) 1.0～5μlRNase抑制剂(40u/μl) 1.0～2.0μl逆转录酶(4u/μl) 1.0～2.0μl甲肝病毒RNA 15.0～30.0μl无核酸酶水 补充至总反应体积25～50μl在37～42℃下反应90～120分钟；将所获逆转录反应产物煮沸45～75分钟；(2)、第一轮聚合酶链式反应在离心管中依次加入下列试剂：10×PCR缓冲液 10.0～15.0μldNTP混合物(2.5～10mmol/L) 2.0～8.0μl反向引物N2(5～60μmol/L) 1.0～5.0μl正向引物M1(5～60μmol/L) 1.0～5.0μlDNA聚合酶(5u/μl) 0.5～1.0μl逆转录反应产物 10.0～15.0μl无核酸酶水 补充至总反应体积100～150μl在94℃预热20～30分钟，之后在94℃变性1～2分钟，在52～55℃退火1～2分钟，在72℃延伸1.5～2分钟，如此循环30～35次后，再在72℃延伸20分钟，得第一轮聚合酶链式(PCR)反应产物；(3)、第二轮聚合酶链式反应在离心管中依次加入下列试剂：10×PCR缓冲液 5.0～7.5μldNTP混合物(2.5～10mmol/L) 1.0～4.0μl引物N3(5～60μmol/L) 0.5～2.5μl引物M2(5～60μmol/L) 0.5～2.5μlDNA聚合酶(5u/μl) 0.25～0.5μl第一轮PCR产物(1～10倍稀释) 1.0～2.0μl无核酸酶水 补充至总反应体积50～75μl在94℃预热20～30分钟，之后在94℃变性1～2分钟，在52～55℃退火1～2分钟，在72℃延伸1.5～2分钟，如此循环30～35次后；再在72℃延伸20分钟，得第二轮聚合酶链式(PCR)反应产物；E、电泳分析和滴度计算用1.5％浓度琼脂糖凝胶对第二轮聚合酶链式反应(PCR)产物进行电泳分析，出现351bp长度的DNA特异性条带者为阳性结果，用Reed-Muench公式计算出滴度。