[发明专利]一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法

摘要

本发明涉及一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，特别是从中分离出一种为糖蛋白的蚯蚓3#纤溶酶组分，其分子量为24056道尔顿，与其它单组分蚯蚓纤溶酶相比较其体内溶栓作用最强，对凝血时间影响最小，可用于开发抗栓和溶栓药物。本发明以滤纸为载体，偶联大豆胰蛋白酶抑制剂，构成蚯蚓纤溶酶亲和层析系统，通过亲和层析和梯度洗脱从蚯蚓匀浆液分离出蚯蚓3#纤溶酶组分。本发明的有益效果是由于改进了亲和层析介质，用廉价的滤纸代替昂贵的珠状琼脂糖，使生产成本大大降低，从而适合于大规模生产，另外它还具有方法简便实用的特点。

主权项

1、一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，其特征在于以滤纸为载体，偶联大豆胰蛋白酶抑制剂，构成蚯蚓纤溶酶亲和层析系统，通过亲和层析和梯度洗脱从蚯蚓匀浆液分离出一种为糖蛋白的蚯蚓3#纤溶酶组分，其分子量为24056道尔顿；本方法的具体步骤如下：(1)用常规方法制备蚯蚓匀浆液；(2)亲和层析系统的制备：a、载体的预处理：载体选用实验室用的定性滤纸，在两层滤纸之间夹一层尼龙窗纱后卷成滤纸卷、将滤纸卷放入烧杯中，将0.5～2.0mol/L的氢氧化钠溶液倒入烧杯中搅拌一小时，倒出溶液；再将同样浓度的氢氧化钠溶液并且其中含有1％～10％的环氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4倒入烧杯中、在50～70℃时搅拌10～60分钟，倒出溶液，用去离子水洗2～3次；b、载体的活化：将上述预处理过的滤纸卷采用常规方法进行活化；c、载体与大豆胰蛋白酶抑制剂偶联：将上述经活化处理后的滤纸卷用0.1mol/L的碳酸氢钠溶液洗一次，然后将其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制剂的碳酸氢钠溶液中，碳酸氢钠溶液的浓度为0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制剂的含量为5～50mg/ml，4～8℃时，搅拌18～22小时，再依次用PH9.0的碳酸氢钠、PH4.0的醋酸-醋酸钠溶液清洗；最后将偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷悬浮于PBS溶液中，该溶液PH7.4、内含1mg/ml的NaBH4，4～8℃时，搅拌一小时，再用PBS溶液洗2～3次；d、装柱：将上述偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷除去水分后装入玻璃层析柱中；层析柱装好后用PBS溶液进行平衡；(3)亲和层析：将蚯蚓匀浆液连续泵入层析柱中，同时监测流出液的纤溶酶的含量，当流出液纤溶酶含量超过4～8μg/ml时，停止进样，然后用PBS溶液平衡；(4)梯度洗脱：借助于梯度混合仪和输液泵进行连续洗脱，洗脱剂是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素组成的混合洗脱剂，用分布收集器收集洗脱下来的样品，分别收集蚯蚓2#、3#、4#纤溶酶组分的洗脱峰，2#、3#、4#纤溶酶组分分别对应2、3、4号洗脱峰；最后将洗脱样品对水透析，冻干保存。