[发明专利]与人乳腺癌转移相关基因的分离和分离方法

摘要

本发明公开了一种高精确度、高通量筛选筛选乳腺癌转移相关基因的分离方法。本发明方法通过建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM－MCF－7细胞系与其亲本人乳腺癌细胞系MCF－7形成配对细胞系作为实验样本，不仅可随时无限量培养获得，且由于实验样本的细胞成分均一，保证了分离结果的精确性和准确性。本发明方法还通过基因表达谱芯片技术分离出了与人乳腺癌转移相关基因，这些相关基因的表达和功能的确认，在乳腺癌药物或基因治疗方面以及在用于制备肿瘤转移芯片、制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台方面，都将有着重要的实际应用价值。

主权项

1.一种与人乳腺癌转移相关基因的分离方法，其特征在于包括：1)用SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠从人乳腺癌细胞系MCF-7中筛选和建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系；2)细胞培养将LM-MCF-7和MCF-7细胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸链霉素和100u/ml青霉素)培养液，在37℃、5％CO2条件下CO2培养箱中培养；3)总RNA提取一步法提取MCF-7和LM-MCF-7细胞的总RNA，用异丙醇沉淀，并过柱纯化；4)cDNA反转录及荧光标记取一定量总RNA，以T7-Oligo(dT)15为引物，合成双链cDNA，纯化；之后将双链cDNA进行体外转录合成cRNA、纯化；取cRNA，用Superscript II反转录酶(200u/μl)，9个碱基的随机序列寡核苷酸引物反转录为cDNA并纯化；取cDNA，用9个碱基的随机序列寡核苷酸引物和KLENOW酶进行荧光标记，之后纯化并抽干；标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120μM，dCTP为60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP为40μM，dNTP为10mM；5)制备人寡聚核苷酸标准基因芯片将Qiagen公司人类基因的Oligo库中的寡聚DNA点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上；点制在芯片上的样品还包括人的12个看家基因作为阳性对照，12条人工合成的与人基因没有同源性的70个碱基的寡聚DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标；整个点阵分成48个亚阵；每个亚阵有22行，22列；点间距为185μm，点的直径约为140μm；6)杂交与洗涤将标记的DNA溶于35μl杂交液中，放入标准基因芯片于42℃杂交过夜；杂交结束后，将芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液体中洗5分钟，再在0.2×SSC中室温洗5分钟，最后甩干用于扫描；杂交液的组分为：3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)筛选确定用ScanArray Express双通道激光扫描仪扫描基因芯片，用GenePix Pro 4.0软件分析芯片上每个点Cy3和Cy5荧光信号的强度和比值，并用Lowess方法归一化；以差异为两倍(即比值大于2.0，小于0.5)的标准来确定差异表达基因。