[发明专利]一种高产促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种高产促胰岛素激素毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌及其构建方法。本发明运用分子生物学技术先构建毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9GLP－1，然后将其线性化后转化进入毕赤酵母GS115中，从而获得能够高效分泌表达促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌，该工程菌的促胰岛素激素产量可达到100mg/L。同时，利用该高产工程菌生产的促胰岛素激素产品，其氨基酸序列不同于天然产品，且已被消除了胰蛋白酶切位点，因此不仅在体内不会被特异性的蛋白酶降解而能够长时间的保持活性，而且由于不会被胰蛋白酶降解，还可以制成口服制剂使用。

主权项

1、一种促胰岛素激素高产毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括：a)构建毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9GLP-1：根据毕赤酵母表达载体pPIC9质粒多克隆位点的序列特点，设计上游引物和下游引物，将克隆的GLP-1直接连入T-vector得到pMDGLP-1，用SmalI和NotI酶切得到GLP-1基因片段；质粒pPIC9用XhoI酶切后补平粘端；再用NotI酶切，回收大片段；将GLP-1基因片段与pPIC9大片段通过T4DNA连接酶连接，筛选阳性转化子从而完成毕赤酵母表达载体pPIC9GLP-1的构建；b)构建毕赤酵母GLP-1生产菌株：重组质粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之线性化，再以醋酸锂转化法转化毕赤酵母菌株GS115感受态细胞；在MD培养基上培养两天，挑取阳性转化子，获得毕赤酵母GLP-1生产菌株；c)筛选毕赤酵母GLP-1高产菌株：通过PCR、Southern杂交和Western blot等方法对转化子进行分子检测，确证GLP-1基因已整合到基因组并正确表达；将各转化子毕赤酵母细胞接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养40～48小时，250r/min，无菌条件下离心弃上清，换成BMMY液体培养基；在诱导过程中，每24小时加入适量甲醇使其终浓度维持在0.75％附近；培养60小时后离心收集各转化子的上清培养基；用Tricine SDS-PAGE蛋白质电泳和密度扫描法检测转化子的GLP-1的分泌表达产量，筛选出毕赤酵母GLP-1高产菌株。