[发明专利]一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，与以往的方法相比，本法操作更为简便，同时由于采用了部分换液的方法，从而使培养细胞所需时间缩短，分离得到的间充质干细胞纯度较高，增殖较快。本发明方法所得细胞形态均一，呈长梭形，传代后，在8代以内的细胞贴壁能力较强，生长速度较快。间充质干细胞来源有限，本方明方法为间充质干细胞的研究和应用提供了丰富的材料来源。

主权项

1、一种骨髓间充质干细胞分离、培养方法，其特征在于它包括：1)原代培养；a)取经水囊法引产后死亡的四个月胎儿股骨组织，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔中的细胞，收集后1200rpm离心7～8分钟；离心后弃上清，用混和培养液I吹打细胞沉淀，使之形成细胞悬液并进行细胞计数；取含有细胞的混合培养液I按细胞培养密度1～1.5×106个细胞/瓶接种于细胞培养瓶中，并用混合培养液I补足至培养液总量为8～10ml，培养两天；b)弃去培养液的一半，再加入4～5ml新鲜的混和培养液I，置于二氧化碳孵箱继续培养使细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养；2)传代培养；待细胞生长至对数生长期后，移去原代培养瓶内的细胞培养液，用PBS溶液清洗细胞2～3次，然后向培养瓶中加入1～2ml 0.125％(质量体积百分比)的胰蛋白酶酶溶液(含0.1％EDTA)，在二氧化碳孵箱中放置2～3分钟，观察，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液；加入5～7ml混和培养液II，吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬液，经1200rpm离心7～8分钟，弃上清，加入8～10ml混和培养液II，计数；将含有细胞的混和培养液II按接种密度1～1.5×106个细胞/瓶接种于新培养瓶中，并用混合培养液II补足至培养液总量为8～10ml，培养至细胞生长良好，形态均一，即完成传代培养。所述混合培养液I的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，15％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。所述混合培养液II的组分为：L-DMEM/IMDM为1∶1，10％胎牛血清，并含有100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。