[发明专利]抗衰老番茄育种方法

摘要

本发明属于农业生物技术领域或植物基因工程领域的一种抗衰老番茄育种方法。该方法采用番茄衰老基因沉默育种技术即反义构建乙烯基因技术，通过调控乙烯信号转导中基因产物的表达，使衰老基因沉默，减少和抑制衰老基因的表达，结合高效、可靠的抗衰老基因筛选技术可加速番茄抗衰老、耐贮藏育种，从而获得抗衰老、耐贮藏新品种，是一种先进的基因工程育种技术。

主权项

1.一种抗衰老番茄育种方法，其育种方法为：(一)该基因克隆的步骤为：(1)番茄的乙烯基因的RNA的提取；(2)通过该RNA的反转录基因cDNA的合成；(3)对合成的cDNA的PCR扩增；(4)乙烯基因-PCR扩增基因的分离和纯化；(5)乙烯基因-PCR扩增基因的克隆；(6)基因转化大肠杆菌；(7)克隆基因的筛选；(8)克隆基因的酶切鉴定；(9)基因序列的分析技术；(二)该基因反向构建的步骤为：(1)带特异性粘性末端的乙烯基因的大量富积A乙烯基因/TEM-T克隆的大量培养；B大量提取乙烯基因/TEM-T质粒；C用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T质粒；D电泳分离该酶切产物；E从胶上纯化带特异性粘端的乙烯基因；F浓缩该基因；(2)带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3的大量富积A大量培养带有PCB302-3质粒的菌株；B大量提取PCB302-3质粒；C用SstI和BamHI酶切PCB302-3质粒；D电泳分离带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3；E纯化；F浓缩；(3)构建A反向连接带有特异性粘性末端的乙烯基因和PCB304-3质粒；B转化感受态细胞EcolI.大肠杆菌；C在抗性培养基上筛选；D对抗性单克隆进行分别培养；E分别提取质粒和酶切鉴定；F测序；G转化农杆菌和在抗性培养基上筛选；(三)反义乙烯基因转化番茄(四)转反义乙烯基因番茄植株的筛选其特征在于：在对合成的cDNA的PCR扩增步骤时，根据番茄的抗衰老基因的基因序列以及PRIMER3软件设计引物，该引物包括全长的基因片段两端带有酶切位点和根据基因内部保守序列设计的一对引物，这一对引物建立如下PCR反应：H2O 加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer 2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag 0.1-0.3微升Mg+ 1-5微升引物1 0.2-0.5微升引物2 0.2-0.5微升上述反应的反应条件：1X 95度 3分钟28-40X 95度 20-30秒 45-70度 2-3分钟 72-76度 1-2分钟1X 72度 10分钟1X 4度 ∞。