[发明专利]一种重组人tPA的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人tPA的制备方法，包括了从工程菌株发酵生产，tPA包涵体的提取、复性、纯化、浓缩，到tPA产品的冷冻干粉制备等的全套生产工艺，其中重点解决了tPA包涵体的复性、tPA纯化等关键技术。利用本发明所提供的制备方法，从10L发酵体积中可生产tPA晶体湿重10克以上，变性、复性后总活性可高达3－4×10⁸IU，总的复性效率＞10％，复性后有活性tPA的回收率达到60％，纯化后tPA的纯度达99％以上。本发明提供的tPA制备方法具有产量高、操作简便、成本低廉、效率高的优点，所提供的生产工艺可很快转化为工业化生产工艺。

主权项

1.一种重组人tPA的制备方法，它包括下列步骤：A、利用工程菌株BL21/rtPAm-1，进行发酵生产重组tPA，工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，CCTCC M205112，利用工程菌株BL21/rtPAm-1发酵生产重组人tPA包括步骤：首先是斜面种子培养：用LB培养基，37℃培养18-20小时；其次是瓶摇种子制备：用2YT培养基，摇瓶培养，37℃培养12-14小时；第三是发酵培养：用发酵培养基，37℃进行发酵培养和诱导蛋白质表达；B、tPA包涵体的提取和纯化：离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心去上清，沉淀用pH8.0的Tris-NaCl-吐温-20和纯净水各洗涤三次；C、包涵体的溶解和变性：按5-10克tPA湿重/升的量将tPA包涵体加到7-8M尿素中，用NaOH调节pH至9-10，加入还原剂β-巯基乙醇至10-20mM，28-32℃搅拌溶解0.5-1小时，进行溶解和变性；D、tPA复性，其方法如下：(a)加水将变性液稀释一倍，使尿素浓度降至4M以下，tPA开始复性；(b)用G50 Sephadex分子筛柱层析逐渐去除复性液中的尿素和还原剂β-巯基乙醇，使tPA逐步复性，同时又去除分子量30kD以下的杂蛋白；(c)将收集的tPA溶液用pH8.0的10mM-20mM Tris-Cl进行稀释，至tPA浓度为1-2克湿重/升，在20-25℃及pH8.0的条件下，放置16-24小时，进行进一步复性；E、柱层析纯化和浓缩：(a)用Q-Sepharose 4 FF柱分离复性正确和复性不正确的tPA蛋白，柱子先用0.5M HCl进行预处理，再用水洗至pH5.0-6.0，然后用2倍体积的pH8.0-8.5的20mM Tris-Cl进行平衡，复性液经过滤后，加入pH8.0的Tris-Cl至20mM，上柱，用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.1-0.5M NaCl进行梯度洗脱，收集有活性的tPA洗脱峰，或用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.15-0.2M NaCl洗脱杂蛋白，再用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.25-0.35MNaCl洗脱有活性的tPA；(b)进一步用疏水层析柱Phenyl-Sepharose 6 FF对tPA进行纯化，柱子用pH6.5-7.5的5mM Tris-Cl，0.4-0.6M NaCl进行平衡，在Q-Sepharose 4 FF柱洗脱的tPA液中加入NaCl至0.4-0.6M，用HCl调节pH至7.0-7.5，上柱，用pH8.0-9.0的2.5-5mMTris进行洗脱，收集有活性的tPA；(c)用膜滤器对tPA洗脱液进行浓缩，至tPA浓度3×105IU/ml；F、tPA冷冻干粉针剂制备：采用冷冻干燥法将浓缩的tPA溶液制成冷冻干粉制剂。