[发明专利]一种稳定标记肝癌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种稳定荧光标记肝癌细胞的方法，其步骤是：肝癌细胞培养、爬片及固定；固定的肝癌细胞爬片的洗涤与封闭；肝癌细胞与作为一抗的特异性AFP单克隆抗体的结合；PBS洗涤爬片；用QDs－IgG复合物探针作为二抗进行荧光标记；PBS洗涤爬片；4’，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)复染细胞核；PBS洗涤爬片和标本的避光保存。本发明方法易行，操作方便，可高效稳定地对肝癌细胞进行荧光标记，对肝癌细胞的长时间观察研究提供了适宜的实验方法。

主权项

1、一种稳定标记肝癌细胞的方法，它包括下列步骤为：A、细胞培养人肝癌细胞株HCCLM6，培养液为含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养条件：37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4～6天传代一次；B、细胞培养玻片和培养皿的处理，将20mm×20mm盖玻片和直径9cm的玻璃培养皿用清水洗净，2％/vol/vol盐酸溶液浸泡过夜，清水浸泡，用软毛刷刷洗，烘箱烘干，温度控制在50～70℃，放酸缸内经硫酸100ml、重铬酸钾100g、清洁液蒸馏水1000ml浸泡1～3天，自来水冲洗20次，蒸馏水洗涤10次，浸泡过夜，烘干后，干烤灭菌，温度控制在150～170℃，2h，备用；C、细胞爬片，将盖玻片平铺于培养皿上，每个培养皿铺4张盖玻片，用0.125％胰蛋白酶消化细胞，按2×106个/每个培养皿接种，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养3d，细胞长满盖玻片；D、洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l、pH 7.2～7.4、PBS(KCl 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl 8g、Na2HPO4·7H2O 2.16g、蒸馏水1000ml)，洗涤2次，每次3min；E、固定，固定液为-20℃甲醇，每张玻片3～5ml，去除上述的剩余PBS后固定15min；F、洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.2～7.4，PBS为上述步骤D，洗涤3次，每次3min；G、封闭，封闭液为含有1％/wt/vol牛血清白蛋白和0.1％/vol/vol曲拉通X-100的PBS，PBS为上述步骤D，封闭条件为：湿盒孵育，37℃，20～30min；H、加一抗，去除上述的剩余封闭液后，滴加鼠抗人AFP单克隆抗体，湿盒孵育，37℃，1～2h或4℃冰箱过夜；I、洗涤玻片，清洗液为含0.5％/vol/vol吐温#20的PBS，PBS为上述步骤D，洗涤3次，每次3min；J、加二抗，去除步骤D的剩余PBS后，滴加QDs-IgG复合物探针，稀释液为含5％/wt/vol牛血清白蛋白的PBS，稀释后IgG浓度为10μg/ml，湿盒，20～25℃避光孵育1h；K、洗涤玻片，清洗液为上述步骤I，PBS为上述步骤D，避光洗涤3次，每次3min；L、细胞核复染，去除步骤D的剩余PBS后，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，稀释液为含5％/wt/vol牛血清白蛋白的PBS，PBS为上述步骤D，稀释后浓度为2μg/ml，湿盒，20～25℃避光染色15～20min；M、洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.2～7.4，PBS为上述步骤D，避光洗涤3次，每次3min，缓冲甘油封片，4℃避光保存。