[发明专利]一种同时纯化微囊藻毒素LR和RR的方法

摘要

一种合理组合利用多步层析法同时分离纯化微囊藻毒素LR和RR的技术，适合于同时制备毫克级微囊藻毒素LR和RR。主要步骤是蓝藻水华样品用5％醋酸处理，提取液过ODS柱，90％甲醇洗脱物经第一次硅胶柱层析得到LR和RR组分，两个组分再分别进行第二次硅胶柱层析、LR再经制备HPLC、RR再经离子交换层析，最后都用C18小柱脱盐，整个分离过程采用薄层层析进行实时监测及纯度鉴定，所得微囊藻毒素LR和RR经HPLC检测纯度均≥90％，可用作标准品。本发明可从水华样品中经一次提取得到两种获得量均在毫克级的微囊藻毒素，对设备要求不高，分离过程所用材料成本低。

主权项

1、一种微囊藻毒素LR和RR的纯化方法，其特征在于，操作步骤按如下顺序进行：A.蓝藻水华样品，加入其重量50倍的5％醋酸溶液，磁力搅拌30分钟，10000g离心20分钟，取上清，沉淀重复上述提取2次，合并三次提取上清，用GF/C滤膜过滤。B.ODS柱，5×60cm，分别用甲醇、20％甲醇、水处理。将A步骤中的滤液过柱，然后分别用水、20％甲醇淋洗，再用90％甲醇洗脱，收集洗脱液。C.洗脱液用旋转浓缩蒸发仪去除有机溶剂，得到毒素粗提物，用薄层层析对洗脱组分进行鉴定，证实其中含有毒素LR和RR。D.硅胶柱1.5×80cm，用展层剂氯仿∶甲醇∶水(65∶35∶10)装柱并平衡，毒素粗提物用展层剂溶解、加到柱上，用展层剂洗脱，分部收集，用薄层层析对洗脱组分进行鉴定，分别合并含LR和RR的组分，旋转浓缩干燥。经本步骤，毒素LR与RR得以分离，得到LR组分和RR组分。E1.LR组分第二次硅胶柱层析，柱1.0×35cm，用展层剂醋酸乙酯∶异丙醇∶水(5∶3∶4)平衡，D步骤经浓缩干燥后的LR组分用展层剂溶解，加到柱上，用展层剂洗脱，分部收集，用薄层层析对洗脱组分进行鉴定，合并含单一成分的组分，旋转浓缩干燥。经本步骤，毒素LR组分中的杂质进一步去除。E2.RR组分第二次硅胶柱层析，柱1.0×35cm，用展层剂醋酸乙酯∶异丙醇∶水(5∶3∶4)平衡，D步骤经浓缩干燥后的RR组分用展层剂溶解，加到柱上，用展层剂洗脱，分部收集，用薄层层析对洗脱组分进行鉴定，合并含单一成分的组分，旋转浓缩干燥。经本步骤，毒素LR组分中的杂质进一步去除。F1.E1步骤的毒素LR组分用甲醇溶解，制备型HPLC，流动相组成为0.02M醋酸铵∶乙睛(75∶25)，进一步将LR与其它结构相近的低含量的毒素分开，得到的LR经HPLC-UV/DAD测定纯度≥90％。F2.E2步骤的毒素组分用甲醇溶解，离子交换柱进一步去除RR组分中的杂质，得到的RR经HPLC-UV/DAD测定纯度≥90％。G.上述制备物分别用C18小柱脱盐。