[发明专利]分泌人干扰素－α2a的重组卡介苗及其构建方法

摘要

本发明涉及一种分泌人干扰素－α 2a的重组卡介苗及其构建方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽片断和人IFN－α 2a的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSIFN－α 2a，然后采用电穿孔技术将pMSIFN－α 2a导入BCG构建重组卡介苗rBCGIFN－α2a，依靠pMSIFN－α 2a在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌IFN－α 2a。本发明得到的重组卡介苗rBCGIFN－α 2a具有BCG和IFN－α 2a的双重效果，能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；利用重组卡介苗rBCGIFN－α 2a在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用IFN－α 2a的用量，可以克服BCG治疗的毒副作用。

主权项

1、一种分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)卡介苗穿梭表达载体的构建：分别设计Ag85B和IFN-α2a的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，IFN-α2a的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI，经聚合酶链式反应分别合成Ag85B信号肽和IFN-α2a基因片段，将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中，得到pMS，再将IFN-α2a基因片断与pMS载体的信号肽连接，得到穿梭表达载体pMSIFN-α2a；2)卡介苗的培养：选取卡介苗为上海丹麦株，将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，液体培养基含有10％的营养剂ADC、0.5％吐温80和0.2％甘油，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期，OD600值＝0.6，制得感受态卡介苗；3)电转化技术构建重组卡介苗rBCGIFN-α2a：在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达载体pMSIFN-α2a，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数：电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω，阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGIFN-α2a，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养；4)重组卡介苗rBCGIFN-α2a的鉴定与功能检测：进行抗酸染色初步确定rBCGIFN-α2a为抗酸杆菌，抽提rBCGIFN-α2a质粒DNA后，PCR扩增得到IFN-α2a的基因片断，Western Blot检测到rBCGIFN-α2a培养上清中和菌体中有IFN-α2a蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGIFN-α2a培养上清中有高含量的IFN-α2a。