[发明专利]体外抑制AF116909基因诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法

摘要

提供一种体外诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法，包括神经干细胞分离、培养和鉴定后，在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12－DMEM(1∶1)培养基中加入bFGF、肝素、层粘连蛋白后，于37℃、50mL/LCO₂饱和湿度下诱导分化神经干细胞并体外培养7天，然后作胆碱能神经元的免疫鉴定。本发明的方法操作简单，重复性好，分化率达30％以上。是一种获得胆碱能神经元的新途径。

主权项

1.一种体外抑制AF116909基因诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的方法，包括以下步骤：(1)神经干细胞的分离、培养和鉴定；(2)shRNA表达载体的构建：按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法设计转录shRNA的对应于AF116909基因的回文序列，将两条回文序列在95℃退火合成双链序列，再与线状的pSilenCircle载体连接，转化到感受态的DH5α进行扩增，质粒抽提，测序鉴定；(3)NSC的转染：转染当天，将NSCs传代，吹打制成密度为106-108个/mL的细胞悬液，取5mL该悬液置于60-mm的培养瓶中；将经测序确定为shRNA的表达载体6.0μg-10.0μg稀释在500μL无抗生素、无血清的DMEM中；同时将20μL的LipofectamineTM2000转染试剂稀释在同样体积的上述DMEM中，室温下培养5分钟后；然后将稀释的shRNA表达载体同稀释的转染试剂混合，室温培养20分钟后，最后再将此混合物转染到NSCs中；(4)胆碱能神经元的鉴定。