[发明专利]内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量

摘要

本发明公开了一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法。本发明将多糖代谢途径的两个代谢反应偶连的关键酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因)，经体外修饰，增加强化表达的调控元件，构建成功中间载体，通过电穿孔法将表达中间载体pBI－UG转入发根农杆菌LBA－9402，获得转多糖合成双基因的黄芪毛状根。其中黄芪甲苷的含量比未转基因的黄芪毛状根高6倍。

主权项

1、一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法，其特征在于：包括下列步骤：1)总核糖核酸提取：反应试剂的配制：变性液26mM柠檬酸钠pH4.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.125M 2-巯基乙醇，4M异硫氰酸胍；NaAc2M，pH4.7；酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1；70％乙醇；所有的试剂皆用0.1％焦碳酸二乙酯水处理过的无核糖核酸酶水配制，玻璃容器皆去核糖核酸酶；操作程序：取适量新鲜植物组织置于陶瓷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉末，转移至含有650μl变性液的1.5ml离心管中混匀；加入65μl 2M NaAc pH4.0，反复颠倒混匀；再加入650μl酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1，混匀，冰浴15min；4℃，12000rpm，离心20min；上清转移至一新的1.5ml离心管中，加等体积异丙醇，混匀后-20℃置30min；4℃，12000rpm，离心10min沉淀核糖核酸；弃上清液，将核糖核酸溶于0.5ml变性液中，65℃加热尽快溶解；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重复前步骤；离心后，弃上清液，加75％预冷乙醇1ml，漂洗沉淀，离心同上，弃上清；空气干燥后，加20μl无菌双蒸去离子水溶解核糖核酸，分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度，余下部分-20℃保存备用；2)逆转录互补脱氧核糖核酸寡聚脱氧胸苷酸37.5μM 2μl，总核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水10.5μl，70℃反应10min，立即置冰上，5×逆转录缓冲液4μl，核糖核酸酶抑制剂40U/μl 0.5μl，10mM脱氧核酸核苷三磷酸1μl，逆转录酶200U/μl 1μl，42℃反应1.5h，70℃反应10min灭活逆转录酶；3)引物设计根据尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因的互补脱氧核糖核酸序列设计引物P2：5’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI：5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’P20：5’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P21：5’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’构建双基因载体时扩增引物为：Psf：5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr：5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)聚合酶链式反应扩增互补脱氧核糖核酸1μl，引物15μM 2μl，引物25μM 2μl，10×缓冲液2μl，MgCl2 25mM1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，无菌双蒸去离子水94℃变性5min→94℃变性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30个循环→72℃延伸7min；5)连接pGEM-T载体：T4脱氧核酸缓冲液10×1μl，pGEM easy载体50ng/μl 1μl，聚合酶链式反应纯化产物适量，T4脱氧核酸连接酶3U/μl 1μl，无菌双蒸去离子水，将反应液混匀后4℃放置；6)感受态细菌的制备：从-70℃低温冰箱取出菌种DH5α，接种于LB平板，37℃培养过夜进行活化，从活化平皿上挑取单菌落，接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜250rpm，次日按1％V/V比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.3～0.6也可，在无菌条件下，将50～100ml培养液转入两个预冷的无菌离心管中，冰上静置10min。4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液。倒置流尽培养液。加10ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加2ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，即为感受态细胞，7)转化与克隆筛选在制得的感受态细胞中加4μl载体连接质粒脱氧核酸，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板加相应的筛选抗生素，再加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl，37℃恒温培养箱过夜培养，根据蓝白斑筛选阳性克隆；8)分别以引物对腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物PxbaI-P2扩增腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因模板1μl，引物15μM 2μl，引物5μM 2μl，10×缓冲液2μl，MgCl2 25mM 1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，无菌双蒸去离子水94℃变性5min→94℃变性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3个循环→94℃变性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27个循环→72℃延伸7min，测序；9)双酶切：10×双酶切缓冲液10μl，限制性核酸内切酶XbaI 10U/μl 3μl，限制性核酸内切酶SacI 10U/μl 3μl，脱氧核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水37℃水浴1hr，取出75℃灭活内切酶，取5μl电泳鉴定，其余部分酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1纯化后，加1/10体积的3M NaAc，2体积的乙醇沉淀脱氧核糖核酸，静置10min后，12000rpm，4℃，离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤两次后晾干约10min，加适量的无菌水溶解，进行与载体的连接或者-20℃保存待用；10)质粒pBI121的提取、双酶切反应试剂的配制：LB液体培养基；溶液150mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH8.0；溶液20.2M NaOH，1％十二烷基硫酸钠；溶液35M KAc 60ml，HAc 11.5ml，无菌双蒸去离子水28.5ml；酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶20μg/ml；无水乙醇；70％乙醇；操作程序：取2ml含抗生素的LB液体培养基，加入15ml的通气良好的试管中，然后从转化平板上挑一单菌落，37℃，300rpm，培养过夜；取1.5ml培养物，4℃，12000rpm，离心0.5min，倒去上清液，沉淀尽可能干燥；加100μl溶液1重新悬浮细菌，剧烈震荡；加200μl溶液2，盖紧盖子，快速颠倒混匀，置冰上；加150μl冰预冷的溶液3，盖紧盖子，颠倒混匀，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，离心5min，上清转移；加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，4℃，12000rpm，离心2min，转移上清液；在上清中加2倍体积乙醇，室温放置2分钟；12000rpm，4℃，离心5min；弃上清，沉淀晾干；再加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，沉淀空气干燥10min；加50μl含核糖核酸酶的无菌双蒸去离子水溶解脱氧核糖核酸，储存于-20℃待用；再按步骤9)方法双酶切；11)质粒与插入片段的连接10×连接缓冲液1μl，步骤9)双酶切纯化后脱氧核糖核酸，载体pBI121插入片段和载体的摩尔比例约为2∶1，T4脱氧核糖核酸连接酶5U/μl 1μl，无菌双蒸去离子水，16℃水浴过夜；12)转化在制得的感受态细胞中加4μl质粒连接产物，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板加相应的筛选抗生素，37℃恒温培养箱过夜培养，PCR方法筛选阳性克隆；13)分别以腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因特征引物和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物聚合酶链式反应扩增筛选阳性克隆，按步骤7)方法进行；14)分别提取质粒pBI-GBSS、pBI-UGP，连接获得pBI-UG。其中对pBI-GBSS进行限制性核酸内切酶ScaI酶切，回收酶切片段。用引物对Psf-Psr，以质粒pBI-UGP为模板，进行聚合酶链式反应扩增，10×反应缓冲液2μl，MgCl2 25mM 1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶5U/μl 0.2μl，引物1 Psf 5μM 2μl，引物2 Psr 5μM 2μl，质粒pBI-UGP0.5μl，无菌双蒸去离子水，聚合酶链式反应循环条件与步骤7)相同。聚合酶链式反应产物进行切胶回收，再用限制性核酸内切酶ScaI进行酶切，回收酶切产物后与载体pBI-GBSS连接，筛选阳性克隆，获得pBI-UG；构建成功双基因表达载体pBI-UG，分别添加了CaMV 35s强启动子和Nos-ter强终止子序列；15)电穿孔法转化发根农杆菌接种发根农杆菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出，挑单菌落接种于加100μg/ml利福平的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养约40hr，按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养至OD600为0.5。置冰上5min后，5000rpm，4℃离心10min，1mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸、pH7.0洗涤农杆菌沉淀2～3次，每次洗涤后分别5000rpm，4℃离心10min，10％甘油悬浮沉淀，取悬浮的细菌1ml，加转化质粒200ng左右，轻微混匀后，置冰上1min。取40μl上步的菌液置于2mm的电穿孔杯中，加2500V电压，25uF电容，电穿孔10mS后，将菌液转移至0.5ml YMB液体培养基中，25℃培养2～3hr后铺于含50μg/ml卡那霉素的YMB平板，25℃培养3～4天后即见到单菌落，挑单菌落进行聚合酶链式反应鉴定按步骤7)方法进行，阳性菌落接种于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养过夜，再对菌液进行聚合酶链式反应鉴定，确定阳性菌LBA9402-UG。16)转多糖合成双基因发根农杆菌侵染黄芪无菌苗接种发根农杆菌LBA9402-UG在含有100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出，挑单菌落接种于加100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养约40hr，按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养过夜，加适量乙酰丁香酮至终浓度50μM，再培养一天，无菌条件下，切取黄芪无菌苗的茎和叶片，在切口处接种悬浮培养过夜的转多糖合成双基因的发根农杆菌LBA9402-UG菌液OD600＝0.5，然后转移至MSOH固体培养基，25℃、黑暗条件下培养2天，无菌水洗涤外植体4～5次后，转移至含500mg/L凯福隆的固体MSOH培养基，25℃、黑暗条件下培养诱导产生毛状根。