[发明专利]一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法

摘要

本发明公开了一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，其特征在于以下步骤：1).收获骨髓细胞；2).收集单个核细胞；3).制备EBM－2细胞培养液；4).细胞原代培养；5).细胞传代培养。在步骤3)的制备EBM－2细胞培养液中加入bFGF和VEGF生长因子促进了血管内皮前体细胞的增殖。因此本发明能够在短时间内获得大量的血管内皮前体细胞。

主权项

1、一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)、收获骨髓细胞：用注射器吸取含100IU/ml肝素的EBM-2培养液，通过针头注入骨髓腔，收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用注射器反复吹打成细胞悬液；以1000rpm的速度离心洗涤5分钟，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞；2)、收集单个核细胞：全骨髓细胞吹打均匀，用滴管轻轻滴加到密度为1.083g/ml的histopaque-1083分离液上，以2200rpm的速度离心20min，取界面层的单个核细胞，培养液两次洗涤；3)、制备EBM-2细胞培养液：在含10％胎牛血清的EBM-2细胞培养液中加入2ng/ml的bFGF和10ng/ml的VEGF生长因子；4)、细胞原代培养：将骨髓单个核细胞以5×106/cm2接种培养皿，加入上述EBB-2细胞培养液，置入37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，48hrs后首次换液，去除悬浮细胞，后每2-3d换液一次；5)、细胞传代培养：待细胞长至80％融合状态时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液消化，再用含FBS的EBM-2基本培养液中止消化，洗涤后计数，按1∶3比例传代，置于含CO2的培养箱中培养，培养4-7天，传代至2-5代。