[发明专利]海绵中具有抗菌功能协同增强效应的组合菌筛选方法

摘要

一种海绵中具有抗菌活性协同增强效应的组合菌筛选方法。首先采用海绵浸泡液稀释涂平板和海绵碎块直接培养两种途径分离微生物，经单菌落反复划线得到纯菌株；以标准致病菌为指标菌，采用抑菌圈法进行抗菌活性菌筛选；对得到的活性菌进行组合，通过对比单菌的抗菌活性变化得到抗菌功能协同增强的活性菌组合；将活性菌组合的发酵液的乙酸乙酯萃取物添加到指标菌的培养基中，通过观测指标菌细胞浓度与生长曲线的变化对活性菌组合进一步确认；最后采用形态学观察、生理生化分析与16S rDNA序列信息相结合的方法对活性菌组合的组成菌进行种属鉴定。本发明可以得到单菌所不具备的抗菌效果，从而实现多菌协同诱导产生的活性物质的制备。

主权项

1、一种海绵中具有抗菌活性协同增强效应的组合菌筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)海绵共附生微生物的分离：两种方法择一进行，一种是将海绵无菌条件下切成细块，浸泡于无菌人工海水或天然海水中震荡释放微生物，经过0.45μm膜过滤得到含菌液体，梯度稀释后涂布于人工海水配置的细菌培养基平板上培养，挑取单菌落，反复划线得到纯的菌株；另外一种方法是直接将海绵碎块置于人工海水配置的细菌培养基平板上培养，挑取单菌落，反复划线得到纯的菌株；(2)活性菌的筛选：采用致病菌为指标菌，使用琼脂扩散法对步骤1分离到的菌株进行抗菌活性筛选，采用纸片法进行验证，得到具有抗菌活性的菌株；(3)活性菌组合的筛选：对步骤2得到的具有抗菌活性的菌株，采用细菌培养基培养到生长对数期后，按照相同细胞浓度进行组合，以步骤2中相同的指标菌采用琼脂扩散法进行活性菌组合的抗菌活性检测，通过对比单菌株和活性菌组合的抗菌活性差异，从中得到抗菌活性增强的菌株组合，然后，对于得到的活性菌组合进行混合发酵培养，将发酵液的乙酸乙酯萃取物添加到指标菌培养基中进行抑制指标菌生长的实验，考察指标菌的细胞浓度和生长曲线变化，以此进一步确定活性菌组合的协同增强效应，确定活性菌组合；(4)活性菌组合的组成菌的种属鉴定：对于步骤3中筛选到的活性菌组合的组成菌采用常规形态学观察和生理生化实验进行初步的鉴定与分类，同时提取组成菌的DNA，聚合酶链式反应得到16S rDNA片段，进行序列测定，将得到的16S rDNA序列提交基因数据库，通过序列比对进行同源性和系统发育树分析，结合传统分类结果对菌株进行鉴定。