[发明专利]分离筛选异养硝化细菌的方法

摘要

本发明涉及一种分离筛选异养硝化细菌的方法，首先制备牛肉膏—蛋白胨液体培养基，加入琼脂后加热灭菌，冷凝成平板固体培养基，然后将混合微生物菌群均匀涂布于牛肉膏—蛋白胨平板，静置冷凝后于生化培养箱30℃下培养7－10天，在形成的菌落中挑取单菌落到牛肉膏—蛋白胨平板划线纯化得到纯菌，然后将纯菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，采用格利斯试剂直接点滴入适量培养液中进行硝化活性鉴定，鉴定试验以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养液作空白对照。本发明通过牛肉膏—蛋白胨琼脂平板分离，氨氧化能力鉴定液体培养基培养和格利斯试剂显色等步骤，可从混合微生物系中分离筛选异养硝化细菌，具有简便，重复性好，准确可靠的特点。

主权项

1、一种分离筛选异养硝化细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)牛肉膏-蛋白胨培养基的制备：按牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，1000mL蒸馏水的比例配制液体培养基，先将牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶解于蒸馏水中，用1mol/L的NaOH调节培养基pH为7.0～8.0形成液体培养基，经121℃高温高压灭菌15～20分钟；在上述牛肉膏一蛋白胨液体培养基中加入15～20g琼脂，加热使其充分溶解后装于锥形瓶中，于121℃下灭菌15～20分钟，待培养基冷却至45～50℃后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板，得到牛肉膏-蛋白胨培养基；2)混合微生物菌群的稀释：将样品与无菌蒸馏水按体积比为1∶9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品；3)混合微生物菌群的涂布：从各个稀释度的样品中均取0.1mL分别加入到制备好的牛肉膏-蛋白胨培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释样品分散摊开使其干燥，每个稀释度的样品三个重复，每变化一次稀释度系列，要重新换移液管，静置冷凝后，将培养基平板扣过来放于生化培养箱30℃下培养7-10天；4)细菌的纯化分离：在形成菌落的平板内，挑选出90-110个孤立菌落的平板，在水平层流双人净化工作台上，把装有选出平板的培养皿中的孤立菌落用接种环挑出，移植到牛肉膏-蛋白胨培养基上，30℃条件下培养7-10天，然后，再用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，用此细菌悬液按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反复2-3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株；5)氨氧化能力鉴定培养液的制备：取葡萄糖5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4.7H2O0.3g/L，FeSO4.7H2O0.03g/L，CaCO37.5g/L，充分混合溶解后分装于玻璃试管中，每只试管分装3mL，用硅胶塞塞紧，于110℃下高压灭菌20min，制得氨氧化能力鉴定培养液；6)格利斯试剂的配制：称取对氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和100mL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氨基苯磺酸溶液；称取0.1gα-萘胺溶解于100mL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得α-萘胺溶液；将两种溶液等量混合成格利斯试剂使用；7)液体纯培养的硝化活性验证：将经分离纯化后获得的异养菌株用接种环挑取一菌环细菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，30℃条件下培养7-10天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照，若培养液变红即可确定菌株具有硝化活性。