[发明专利]堆肥微生物总DNA的提取与纯化方法

摘要

本发明涉及堆肥中微生物总DNA的提取和纯化。本发明用磷酸盐缓冲液洗涤样品，用溶菌酶溶液和SDS溶液裂解堆肥微生物细胞，粗提的DNA经异丙醇离心沉淀和70％冰乙醇洗涤，用聚乙二醇和DNA特异离心吸附柱纯化粗提的DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测表明，提取的DNA片段长度约为23kb；纯化后的DNA经紫外分光光度计检测，腐殖酸类的产量为1.5μg/g堆肥，去除了大部分的腐殖酸类物质；用核酸蛋白质分析仪对纯化的DNA进行检测，DNA的产量为53μg/g堆肥。本发明堆肥微生物总DNA的提取与纯化，能去除DNA中的腐殖酸类物质的干扰，得到的高质量DNA可直接用于PCR扩增及其他分子生物学分析，从而建立一套可用于城市生活垃圾堆肥微生物分子生态学研究的快速、高质、高量的DNA提取与纯化技术。

主权项

1、一种堆肥中微生物总DNA的提取与纯化方法，包括DNA的提取与纯化，本发明的特征在于：(1)样品的洗涤：待提取DNA的样品用0.12M磷酸盐缓冲液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃温度条件下，以150rpm速率匀速震荡15～30min，然后以6000×g离心10min，沉淀再次洗涤；(2)DNA的提取：样品洗涤后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒温条件下，以200～250rpm振荡温浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解缓冲液、磷酸盐缓冲液和氯仿—异戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋涡振荡10～15min，经0.6倍体积的异丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度离心10～20min，沉淀用0.8～1.5ml的冰70％乙醇洗涤两次后溶解于500～1000μl的TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的纯化：粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍体积的聚乙二醇和0.1倍体积的NaCl溶液在4℃温度条件下沉淀2～24小时，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特异离心吸附柱内，在4℃，12000×g离心1min，DNA吸附于柱上，弃去收集管废液，重复上述操作直至粗提DNA溶液全部离心完毕，吸附柱上的DNA经0.7ml冰70％乙醇洗涤两次，再用含RNaseA的TE缓冲液100～500μl洗脱DNA，得到纯化的DNA溶液。