[发明专利]同时检测A、B型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒，针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及相应探针不同DNA序列，分别建立和优化包括引物、探针、酶、寡聚核苷酸和镁离子的A型、B型定量反应体系和反应条件，检测并建立标准曲线，试剂盒包括：RT－PCR反应缓冲液、Taq酶、RT－PCR酶、RT－PCR酶稀释液、DEPC水、阳性对照、阴性对照。解决了双重荧光定量PCR检测体系等问题，具有操作简单、可定量、污染少、检测速度快等优点，可同时检测A、B型流感病毒，检出病毒的最小量达10^－5TCID50，可广泛用于医学和农业等领域。

主权项

1、一种同时检测A型和B型流感病毒的实时荧光定量检测方法，过程包括合成引物和荧光探针，和使用所述的引物、探针组成荧光聚合酶链式反应体系，从待测标本中提取DNA或提取RNA，加入前述的反应体系中，经混合后进行RT-PCR扩增和荧光信号测定，其特征在于：(1)针对A型、B型流感病毒保守序列的引物及相应探针，具备如下DNA序列：A型上游引物：5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物：5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探针：5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1；B型上游引物：5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物：5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探针：5’CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2；(2)建立和优化包括引物、探针、酶、寡聚核苷酸和镁离子的A型、B型定量反应体系和反应条件：(2-1)建立具有如下组分浓度的50μl反应体系：10倍反应缓冲液5μl，镁离子5mM，寡聚核苷酸4mM，RNA酶抑制剂40U，反转录酶25U，Taq酶5U，A型上、下游引物各0.5mM，B型上、下游引物各0.5mM，A型探针250nM，B型探针200nM，A、B型模板RNA各10μl；(2-2)确立如下的反应条件：先48℃30分钟；再95℃10分钟；最后95℃15秒，60℃1分钟，循环45次，然后选择荧光定量PCR仪上FAM和CY5双色荧光通道进行检测；(2-3)建立标准曲线：取流感A、B病毒培养液抽提RNA，然后将RNA进行10倍梯度稀释，最高稀释度为10-6，各浓度梯度RNA同时进行荧光反应，计算并汇出标准曲线。