[发明专利]深圳5号非洲菊的转基因技术

摘要

一种深圳5号非洲菊的转基因技术，其特征在于包括质粒导入根癌农杆菌、LBA4404种子液的制备和保存、农杆菌的转化三大步骤，其中，步骤三——农杆菌的转化包括活化农杆菌、外植体与菌液共培养、除菌培养、抗生素筛选、拟转基因植株的复壮和增殖培养五个分步骤。本方法将含有嵌合的CaMV35S.HPT基因和一个嵌合的CaMV35S.GUS基因转化深圳5号非洲菊单芽，获得了转基因植株，为生产上转化其它目的基因、获得转基因非洲菊新品系(种)提供技术。本方法具有稳定性好、再生和转化效率高的优点。

主权项

1、一种深圳5号非洲菊的转基因技术，其特征在于包括如下步骤：步骤一，质粒导入根癌农杆菌：按照常规的中间载体质粒DNA直接导入农杆菌的方法，将pCAMBIA1301导入根癌农杆菌LBA4404中；涂板培养，培养基采用配方为YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L链霉素的固体培养基A，在28±1℃条件恒温培养46～50h；步骤二，LBA4404种子液的制备和保存：挑取上述培养获得的含pCAMBIA1301质粒的LBA4404单菌落，接种至培养基B：即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L链霉素的液体培养基中，28±1℃、180～220r/min条件下振荡培养24～36h；加入体积百分比浓度为80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最终甘油浓度为20％；将甘油菌液混合液，即LBA4404种子液分装至eppendof管中，置于-70～-80℃条件下保存备用；步骤三，农杆菌的转化：包括如下步骤(1)活化农杆菌：取步骤二所得LBA4404种子液5～8μl接种于10～15ml步骤二的培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件培养23～25h；取1ml的菌液转接到40～50ml新鲜培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件继续培养10～14h；将培养的菌液转入eppendof管中，5000r/min，离心5min，去除上清液；用植物诱导培养基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培养基悬浮沉淀；在分光光度计上测定所得菌液的OD600值，OD600值为0.4～0.5时为活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最终浓度为20～30mg/L，备用；(2)外植体与菌液共培养：将分步骤(1)所获得的备用菌液，在28±1℃、180～220r/min条件下振荡培养1～2h；切取S5组培苗的单芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方为MS+BA 2～3mg/L+IAA 0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+琼脂1％、pH 5.2～5.5的共培养基中，24±1℃、黑暗条件下共培养3～4d；(3)除菌培养：将分步骤(2)培养后的单芽外植体用含500mg/L头孢拉定的无菌水冲洗，吸去表面水分；转入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+头孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+琼脂条0.8％，pH5.6～5.8的除菌培养基上除菌培养3～4d，培养条件为24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素筛选：将除菌培养后的单芽转入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+头孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+琼脂条0.8％，pH5.6～5.8的选择培养基上培养，每7～10d转瓶一次，转瓶3～4次后，单芽基部诱导出不定芽；(5)拟转基因植株的复壮和增殖培养：将分步骤(4)诱导出的不定芽切下，转入MS+BA 0.5～0.8mg/L+IAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽复壮和增殖培养基上，进行复壮和增殖10～15d；再将不定芽转入与分步骤(4)相同的选择培养基上继续培养30～40d；最后将生活力强的拟转基因不定芽转至MS+IAA 0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培养基上培养，20～30d可获得具有根的完整的拟转基因植株。