[发明专利]BCR－ABL融合基因(P210bcr/ab l)mRNA荧光定量RT－PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种BCR－ABL融合基因(P210^bcr/abl mRNA)荧光定量RT－PCR检测试剂盒，该试剂盒包含总RNA提取液(细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II和无RNA酶的水)，反转录反应液，dNTP混合物，逆转录酶，PCR反应液，探针，阳性标准品，对照品。本发明通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中P210^bcr/abl的mRNA的表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中检测慢性粒细胞性白血病患者的外周血中P210^bcr/abl mRNA的表达，为慢性粒细胞性白血病的早期诊断、复发、治疗方案的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

主权项

1.BCR-ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征为：它包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；以上各种溶液所用溶剂均为水；(1)、细胞裂解液I包含0.1mol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水；(2)、细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水；(3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(5)、无RNA酶的水通过以下方法制得：向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，20min高压，室温放置备用；(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的；(7)、反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)12-18、3.6U/μl Rnase Inhibitor、72.7mmol/L DTT(二硫苏糖醇)、182mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/L KCl、11mmol/L MgCl2、水；(8)、逆转录酶储存液包含20mmol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶(M-MLV)、水；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L；(10)、PCR反应液包含18.5mmol/L Tris-HCI(pH8.3，25℃)、2.78mmol/L MgCl2、92.6mmol/L KCI、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μl Taq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其浓度均为400nmol/L)、水；上下游引物序列分别为：P1：5’-AGC ATT CCG CTG ACC ATC A-3’，P2：5’-GCG TGA TGT AGT TGC TTG GGA C-3’(11)、探针为荧光标记探针，其序列为：5’-FAM-TTT GGG CTT CAC ACC ATT CCC CAT TG-TAMRA-3’探针的浓度为：2μmol/L，TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)溶解；(12)、标准品的序列为：1 AGCATTCCGC TGACCATCAA TAAGGAAGAT GATGAGTCTC CGGGGCTCTA51 TGGGTTTCTG AATGTCATCG TCCACTCAGC CACTGGATTT AAGCAGAGTT101 CAAAAGCCCT TCAGCGGCCA GTAGCATCTG ACTTTGAGCC TCAGGGTCTG151 AGTGAAGCCG CTCGTTGGAA CTCCAAGGAA AACCTTCTCG CTGGACCCAG201 TGAAAATGAC CCCAACCTTT TCGTTGCACT GTATGATTTT GTGGCCAGTG251 GAGATAACAC TCTAAGCATA ACTAAAGGTG AAAAGCTCCG GGTCTTAGGC301 TATAATCACA ATGGGGAATG GTGTGAAGCC CAAACCAAAA ATGGCCAAGG351 CTGGGTCCCA AGCAACTACA TCACGC标准品的浓度为：106copies/μl，TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)溶解；(13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有P210bcr/abl cDNA的样品(104copies/μl，TE溶解)，阴性对照品为正常人外周血总RNA的反转录产物。