[发明专利]表皮生长因子受体(EGFR)基因测序检测方法

摘要

本发明涉及一种表皮生长因子受体基因检测分析方法，属于分子生物学技术社会应用领域。本发明设计的EGFR第18、19和21外显子基因片段，可以逐个从碱基和氨基酸水平与观察分析中国人特有的该基因序列特征和突变特点，本发明人发现的第21外显子T＞G突变和A＞T及852位密码子始插入G突变是国内外均未见报道的新的杂合性突变，用于鉴定中国人靶向药物治疗，具有针对性。本发明提供了一种检测EGFR基因突变的检测方法，检测后再决定是否服药，可明显控制吉非替尼的不良副作用，减少不必要的经济负担，提示非小细胞肺癌分子靶向药物治疗的良好效果。

主权项

1、表皮生长因子受体(EGFR)基因测序检测方法，它包括下列步骤：(1)检测材料和对象各种途径获取的非小细胞癌的体细胞组织、肺癌的石蜡包埋组织的切片、肺癌晚期转移灶组织和血液中的癌细胞、肺癌胸水和穿刺细胞或痰细胞；(2)使用试剂和仪器DNA提取的试剂盒PCR纯化试剂盒ABI测序试剂盒仪器：DNA  定量仪  电泳仪  自动凝胶显像系统  PCR仪  冷      冻离心机     基因测序仪     基因分析软件(3)检测流程首先对检测材料进行病理学技术制片，观察，出具病理诊断报告；备案，判断是否为非小细胞肺癌并病理分类，选定病灶区域后取材切片纳入基因测序检测；组织前处理及抽提DNA，每批组设立肺癌周围组织对照；DNA定量仪检测样本质量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280比值1.6-1.8，320nm波长处吸光率接近零)；使用已设定的引物(EGFR外显子18、19和21全长DNA序列)进行PCR扩增；凝胶自显影电泳观察分析PCR效果；PCR产物纯化；PCR产物进行测序反应；使用基因测序仪进行EGFR基因的测序和分析；如阴性结果时做双向测序检测；依据病理诊断，临床检查治疗情况和序列分析结果进行综合评估；完成EGFR病理基因测序报告；(4)观察指标依据美国国立医学图书馆(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFRDNA公开序列(NM-005228)和mRNA的序列，确定EGFR第18、19和21外显子全长片断；①EGFR第18外显子片段长度为437bp，主要观察核苷酸2155G＞A突变，即氨基酸G719s改变②EGFR第19外显子片断长度为411bp，主要观察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I 759del缺失现象其它核苷酸片段缺失、插入、重复现象，如氨基酸L747-T75linsS，L747-P753insS和L747-A750del；③EGFR第21外显子，片段长度为399bp，主要观察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R现象改变核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)核苷酸q852其它核苷酸杂合突变现象，如氨基酸L861Q改变；首先确定EGFR第18、19和21外显子基因碱基序列及其突变位点：根据美国国立图书馆(www.NCB5.NLM.NIH.gov)公开提供的EGFR全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，参照美国ABI公司Cerelar数据库相关基因文献和《science》2004、304(5676)：1457-1500，Epub EGFR全基因组文献，本发明选定需要测序的EGFR基因外显子如下：Exon18EGFR18外显子序列cctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcctctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttacExon19EGFR19外显子序列cagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTExon21EGFR21显子序列tgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcc对上述基因片段的观察突变位点主要包括三方面：(1)已报道的突变位点Exon18    核苷酸第2155位 G＞A突变   (G719S)Exon19    核苷酸第2235-2249缺失     (E746-A750del)          核苷酸第2236-2250缺失     (E746-A75 0del)          核苷酸第2254-2277缺失     (S752-I759del)          核苷酸缺失                (L747-T751insS)          核苷酸缺失                (L747-P753insS)          核苷酸缺失                (L747-A750del)Exon21    核苷酸第2573 T＞G突变     (L858R)          核苷酸突变                (L861Q)(2)中国人的突变位点Exon21    核苷酸第2497位  T＞G     (L833V)          核苷酸第2504位  A＞T     (H835L)          核苷酸第2556位插入碱基G  (Q852)(3)由发明人发现的EGFR18、19和21外显子新突变位点(4)设计引物依据上述EGFR基因片段，确定了EGFR第18、19和21外显子，利用Oligo软件独立设计相应的引物，并参考优化的PCR条件和测序适应性分析，合成引物序列如下：