[发明专利]猪Ⅱ型圆环病毒重组腺病毒和疫苗

摘要

本发明猪II型圆环病毒(PCV－2)重组腺病毒和疫苗属于高新生物技术领域。通过PCR技术扩增PCV－2编码Cap蛋白的ORF2全基因序列，并把该基因序列克隆入腺病毒载体系统的穿梭载体pShuttle－CMV中，与腺病毒载体系统的骨架载体pAdEasy－1共转化大肠杆菌BJ5183菌株获得重组质粒，重组质粒转染HEK293－A细胞获得了重组腺病毒并成功的进行了噬斑纯化，通过RT－PCR、间接ELISA、Western－blot和IPMA证明构建成功表达了PCV－2Cap蛋白的重组腺病毒rAd－Cap。在该重组毒中可以使PCV－2的Cap蛋白获得正确表达和表达量提高，从而能更有效的刺激机体的免疫保护反应。

主权项

1.猪II型圆环病毒(PCV-2)重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：(1)Cap蛋白基因的扩增、克隆以GenBank中序号为AY181946的PCV2-TJ毒株基因序列为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物，在两条引物的5’端分别加入KpnI和HindIII酶切位点；引物1：5’TTC ggT ACC AgC TAT gAC gTA TCC AAg 3’引物2：5’gCC AAg CTT TCA CTT CgT CCT ggT TTT 3’以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因，该基因片段大小为751bp；通过这两个设计的酶切位点，把Cap基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有Cap蛋白基因的穿梭载体pSH-ORF2；(2)含有Cap蛋白基因的穿梭载体pSH-ORF2与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有Cap蛋白基因的穿梭载体pSH-ORF2经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在腺病毒穿梭载体和腺病毒骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经50μg/ml卡那霉素筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒；(3)重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-Cap。