[发明专利]桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法

摘要

本发明公开了一种桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法，解决了桃儿七种子难以萌发以及含鬼臼毒素的愈伤组织诱导困难的问题。具体步骤包括：以野生桃儿七种子为原始材料，获得桃儿七无菌苗，并成功增殖、生根；以该无菌苗不同部位为外植体，进一步诱导愈伤组织。经多代筛选继代培养，建立了适合细胞大规模培养的愈伤组织系统，该培养物中含有目标代谢产物一鬼臼毒素。本发明方法诱导出的愈伤组织中含有鬼臼毒素。

主权项

1.一种桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法，其特征在于它包括以下步骤：1)无菌苗的培养：以野生桃儿七种子为试材，在种子处理阶段用浓硫酸浸泡种子1-2分钟，以种皮变黑为度；换用浓度为300mg/L的赤霉素(GA3)浸泡48小时后，常规灭菌，取出其中的胚接种于MS培养基(1/2MS无机成分，无激素)，在光照培养箱中培养获得健壮的无菌苗；2)无菌苗的增殖和生根：以MS培养基为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2-3mg/L用于无菌苗的增殖；以MS培养基为基本培养基，添加萘乙酸(NAA)0.2-1mg/L用于无菌苗的生根；3)愈伤组织诱导：以无菌苗的胚根、胚轴、子叶和真叶叶柄为外植体，以B5 为基本培养基，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1-5mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1-3mg/L和萘乙酸(NAA)0.2-1mg/L，诱导愈伤组织；4)愈伤组织继代培养：以B5为基本培养基，筛选质地疏松、增殖快的愈伤组织细胞株进行继代培养，胚根、胚轴、子叶来源的愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.2-1mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1mg/L和萘乙酸0.5-1mg/L的培养基中继代；真叶叶柄来源的愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.5-2mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1mg/L和萘乙酸0.5-1mg/L的培养基中继代，建立稳定的细胞培养系统，所建立的该细胞培养系统愈伤细胞中含有目标次生代谢产物-鬼臼毒素。