[发明专利]制备基因工程固定化酶N－糖酰胺酶的方法

摘要

本发明公开了一种制备基因工程固定化酶N－糖酰胺酶(PNGase)的方法，即利用基因工程技术将N－糖酰胺酶与酵母性凝集因子相融合，锚定在甲醇营养型酵母细胞表面，获得一种利用细胞作为载体固定化的N－糖酰胺酶。本发明的方法在固定化过程中酶活性不下降，制得的固定化酶稳定性高，可以重复利用、省去了纯化，大大降低N－糖酰胺酶的生产成本，其生产的N－糖酰胺酶可广泛用于规模化的从农副产品下脚料(蛋黄粉、牛奶)中提取具有生物功能寡糖链。

主权项

1.一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法，由下述步骤组成；(1)重组表达载体的构建：克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)基因，经酶切后插入大肠杆菌载体，命名为vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，经酶切后插入到vector-PNG载体；与N-糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为vector-PNG-A；vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的毕赤氏酵母表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k-PNG-A；(2)重组酵母菌株的构建：用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；(3)重组酵母菌株的培养与诱导：挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝10-20时，5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃～30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养24-48小时，5000g离心5～10分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。