[发明专利]一种快速制备转糖基β－半乳糖苷酶的方法

摘要

本发明公开了一种快速制备转糖基β－半乳糖苷酶的方法，由(1)菌株选择(2)菌种活化(3)菌种培养及产酶(4)收集菌细胞(5)洗涤(6)冻融制备转糖基β－半乳糖苷酶粗酶液(7)应用粗酶液生产低聚半乳糖(8)低聚半乳糖定量分析等步骤组成。本发明的方法简便、快速，成本低，制备的β－半乳糖苷酶粗酶液产量高，作用强，反应快，同时还避免了有毒有机溶液的污染；粗酶液可以直接用于乳品工业中乳糖的水解及其它转半乳糖基反应。

主权项

1.一种快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，由下述步骤组成：(1)菌株选择：选择胞内转糖基β-半乳糖苷酶产生菌；(2)菌种活化：将上述选择的菌种之一，接种于新鲜斜面培养基上活化培养1～2次，活化条件：细菌35～40℃培养16～24小时，真菌于26～30℃培养48～72小时；其中：所述细菌用斜面培养基配方为：乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，NaCl3±2g/L，琼脂20±2g/L，pH 7.0～7.5；所述真菌用斜面培养基配方为：土豆200±2g/L，乳糖10±2g/L，琼脂20±2g/L，自然pH；(3)菌种培养及产酶：将上述活化菌接种于产酶发酵培养液中，细菌于35～40℃摇床培养16～20小时；真菌于26～30℃摇床培养40～50小时，摇床转速为180转/分，然后以相同培养液、相同条件继续转接再培养，直至扩大培养至所需菌量；上述产酶发酵培养基配方依据选择菌株而定，其组分中一般至少含有：乳糖10～20g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L；(4)收集菌细胞：待上述培养达到所需菌量后，以12,000转/分离心1～5分钟，收集产酶发酵培养液中的细菌或单细胞酵母；霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞；(5)洗涤：将上述收集的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶5的比例，将菌细胞悬浮于缓冲液中，混匀后，离心，倾去上清液；(6)制备转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液：将上述离心后收集的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶1的比例，将菌细胞重悬于上述缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，再置室温解冻，共冻融2～5次，如此菌细胞悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；(7)应用粗酶液生产低聚半乳糖：将上述粗酶液以体积比计，按粗酶液∶乳糖溶液＝1∶3的比例混合，于40～60℃进行转糖基反应4～10小时，其中：乳糖溶液浓度为30％重量体积百分比，溶剂是上述缓冲液，待反应完毕后，12,000转/分离心1～5分钟，上清液即含有转糖基反应产物低聚半乳糖；(8)低聚半乳糖定量分析：取步骤(7)制得的上清液，以高效液相色谱(HPLC)和薄层扫描定量分析低聚半乳糖得率。