[发明专利]鱼类胚胎细胞分离与培养方法

摘要

一种鱼类胚胎细胞分离与培养方法，其操作程序是：鱼类胚胎的收集；胚胎(囊胚－原肠后期)细胞分离；胚胎细胞的原代和传代培养；胚胎细胞特征的鉴定，包括形态学、增殖特性、染色体核型的鉴定。胚胎的消毒采用70％酒精浸泡灭菌法，细胞从胚胎中的分离采用撕裂法，胚胎细胞的分离与培养都在完全培养基中进行，细胞培养在普通培养箱中进行，培养温度为24℃，每周传代2－3次。以此方法培养的海水鱼类胚胎细胞具有细胞小、呈圆形或多角形、生长稳定、增殖快速、二倍体细胞比率高等特征。本发明技术操作简单，使用方便，可推广应用于几乎所有鱼类胚胎细胞的分离与培养。

主权项

1.一种鱼类胚胎细胞分离与培养方法，其特征在于它的操作程序是：鱼类胚胎细胞的分离；胚胎细胞的原代和传代培养；胚胎细胞的鉴定：包括形态学鉴定、生长和增殖特性鉴定和倍性检测；胚胎细胞在囊胚期-原肠后期的分离：采集鱼类胚胎，镜检合格后在常温下培养至囊胚后期或原肠后期时使用；先将胚胎放在1×PBS溶液中反复浸洗，然后在70％酒精中浸泡消毒，最后用1×PBS(pH值为7.4)溶液清洗三次；再将胚胎放到少量完全培养基中，在解剖镜下用尖头镊子剥除卵膜，分离出细胞团，从中分离出胚胎细胞，离心后用完全培养基重悬，制成细胞悬液；胚胎细胞的原代和传代培养：将制备好的胚胎细胞接种到24孔组织培养板中培养，加入完全培养基1.0ml，置于24℃培养箱中培养.培养2-3天后，更换培养基，等细胞长满培养孔，按1∶2的比例进行传代，每2-3天更换一次培养基；完全培养基配方为DMEM基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖，20m mol/L HepespH 7.4，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2mmol/L谷氨酸，1mmol/L丙酮酸钠，1mmol/L非必需氨基酸，15％胎牛血清，5ng/ml成纤维生长因子，27.5μM巯基乙醇。形成稳定的胚胎细胞系后，细胞保持较快的生长和增殖速度，保持胚胎细胞的形态；胚胎细胞的鉴定：形态学鉴定：在100×和400×的相差显微镜下观察细胞的外形和细胞大小，胚胎细胞多为圆形，多角形和多边形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞的直径约为15-30μm；生长和增殖特性鉴定：胚胎细胞经多次传代培养以及建立细胞系后，仍保持快速的生长和增殖特性，一般2-3天传代一次，细胞倍增时间为24-30小时；倍性检测：大菱鲆胚胎细胞生长至对数期，在培养基中添加秋水仙素使终浓度为0.5μg/ml，4小时后收获细胞，75mmol/L KCl溶液低渗处理25分钟，3∶1甲醇、冰醋酸固定细胞3次，每次15分钟，冷滴片，空气干燥，5％Giemsa染色20分钟。显微镜下观察染色体形态，统计二倍体细胞的比率，正常二倍体细胞所占比例一般在60％以上。