[发明专利]牙鲆抗病相关MHC基因标记及其辅助育种方法

摘要

一种牙鲆抗病相关MHC基因标记及其辅助育种方法，它的方法是MHCIIB基因的克隆，抗病和感病群体的制备，抗病相关MHCIIB基因标记的筛选，基因标记辅助育种技术的建立。本发明克隆了牙鲆MHCIIB全基因，并从牙鲆抗病和感病群体中鉴定出13种不同的MHCIIB基因型，其中10个基因型(a，b，c，d，e，f，i，j，k，m)在抗病和感病群体中都存在，2个基因型(g和h)只在抗病群体中存在；另有1个基因型(1)只在感病群体中存在。将基因型g和h作为抗病相关MHC基因标记，建立了抗病相关基因标记辅助育种方法。本发明首次克隆了牙鲆MHCIIB全基因并筛选到抗病相关的MHC基因标记，建立了抗病基因标记辅助育种方法。本发明方法具有针对性强、选育效率高的特点，适用于各种鱼类抗病相关标记的筛选和抗病品种选育。

主权项

1、一种牙鲆抗病相关MHC基因标记，其特征在在于它的技术内容包括如下三个方面：1)、牙鲆MHC II B基因的克隆；2)、抗病群体和敏感群体的制备；3)、抗病相关MHC基因标记的筛选；1)、牙鲆MHC II B基因的克隆：利用TRIzol试剂盒从鱼类肝脏中提取总RNA，利用M-MLV反转录得到cDNA第一条链，并利用Smart RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)分别合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACE PCR反应备用；根据不同物种MHC II B的氨基酸序列的同源性设计简并引物，得到一段MHC II B基因的cDNA片段；根据所得片段设计特异引物进行RACEPCR；获得1182个碱基的MHCIIB全长cDNA序列，包括741个碱基的编码区，33bp的5’不翻译区和407bp的3’末端不翻译区，并且具有一个脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和27bp的PolyA尾巴；根据其它亲缘关系相近鱼类的已知MHC II B外显子和内含子的分界位点设计特异引物进行内含子扩增；结果表明牙鲆MHC II B基因组与其它脊椎动物的MHC II B基因组结构类似，包含有5个外显子和4个内含子，其中5个外显子的长度分别为85bp，279bp，274bp，114bp和430bp，而内含子1，2，3和4的长度分别为96/84bp，392bp，85bp和109bp；测定了全部5个外显子和4个内含子的序列，获得了牙鲆MHCIIB全基因序列；牙鲆MHCIIB基因及其推导的氨基酸序列：1 ACGCGGGGAGTGTTCGTCAAGTGAACAGAGGAAC35 ATGGCTTCATTCATCCTCAGCTTCTCCCTCTTCTTCATCACGGTCTGCACAGcaggtaggatcagaacactgatcactgatcaatacact 1 M A S F I L S F S L F F I T V C T125 gatcaatacactgatcaatacatggatcattctctgactcgttttcttgtctgctcttCAGATGGATTTCTGCATTATACGGTGACAGAC 18 A D G F L H Y T V T D215 TGTGAGTTTAACTCCTCGAAGCTGAACGACATCGAGTACACACAGTCTTACTATTACAACAAACTGGAGATCGTCAGGTTCAGCAGCAGT 29 C E F N S S K L N D I E Y T Q S Y Y Y N K L E I V R F S S S305 GTGGGGAAGTACGTTGGATACACTGAGTTTGGAATCAAGAACGCTGAGAGGTGGAACAATGGTCCAGAGGTGATCTCTAGAAGAGGTGAG 59 V G K Y V G Y T E F G I K N A E R W N N G P E V I S R R G E395 AAGGAGAGCTACTGCTTTCACAACGTTGGAATCTTCACAGAATCTGCTCTGACGAAGTCAGgtgagtgtgtgtgtgttgtatgtgtgtga 89 K E S Y C F H N V G I F T E S A L T K S485 gtgtgtgttgtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttggattgtatgtgtgagtgtgtgttgtatgtgttgtatgtgtgtgtgt575 tgtgtgtgttcttcatgttccagatgaaattcataaagaatctgatgagtcaaacttttatttattgtctttgtttcctggaaatagact665 cagctcggtgtcaccacctgctggtcacacgctgtaactacagccgctgacactgaagcttctctttgcttctttatgaaataaaataaa755 ggatgaaacaatcctctgatgttttcagttgatcaatcgaaccacagactaagatccagttcacacctgacgtgaccaacatctgtcttc845 cagCCAAACCCTACGTCAGGCTTAACTCTGTGGCGCCCCCAGCTGGCAaaCATGCCATGTTGGTCTGCAGCGTCTTTGACTTCTACCCCA 109 A K P Y V R L N S V A P P A G K H A M L V C S V F D F Y P935 AACGGATCAAAGTGAGCTGGCAAAGAGACGGACAGGAAGTCACCTCTGATGTCACTTCCACTGATGAGCTGGCAGACGGTGATTGGTACT 138 K R I K V S W Q R D G Q E V T S D V T S T D E L A D G D W Y1025 ACCAGATCCACTCCCACCTGGAGTACATGCCCAAGTCTGGAGAGAAGATTTCCTGTGTGGTGGAACATGCCAGCCTGAGTAAACCTCTGA 168 Y Q I H S H L E Y M P K S G E K I S C V V E H A S L S K P L1115 TCACTGACTGGGAgtaaatacctgtctgtcacttgtctgtctgccccctcgtctgtgtgctcacctgctcagctgtctttctccctttct 198 I T D W D1205 gtgctcagTCCATCCATGCCTGAGTCAGAAAGAAACAAGATCGCTATTGGGACCTCAGGACTGATCCTGGGTCTGACCTTATCTCTGGCT 203 P S M P E S E R N K I A I G T S G L I L G L T L S L A1295 GGATTCATCTACTACAAGAGGAAGGCCCAAGgtcagagccagaaacccatttcacaccagtttatacagaccaaatccagtttagaccag 230 G F I Y Y K R K A Q1385 ttttaatggtgtgtatttgttttgacccttgtctcttctctttaaaccagGACGGGATCCTGGTTCCCACTAACTGAGTCTTGTCCTGGA 240 G R D P G S H *1475 CCTGGACTTGGTCCTGGATCTATTTCTGTTTTCCTGATGGAAGTAAAATTAGCTGCTGCTTCAACCTGCTTTCTGTTTTCAGTCCAGCAG1565 ACTCAGCGCTGCCACCTGCTGGACTTGCTGAACACCAAATTCTCTGATGGTCTGTGCTGGTCTGAACCTGATCTAGAACCAGTCCTGTTC1655 TCACTGTGGATCCAGACTCTGGTACATCAGCTGGATCACAAACACCTGATTTGTTGCTTCACGGTGTGAAATCTATATTTTTTTTCTCAT1745 CCTCCTGTTGTTAAACAGTTTTAAATCCTCTTTGATTCAGATCTCAGGTGTCTATACTTTTACTGTTTTCTAATCAAAATAAACTTTGAA1835 CCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。2)、抗病群体和敏感群体的制备：采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体和不抗病群体；在发病旺季，从养殖场收集发病后存活的个体，同时用病原菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵抗能力大小获得抗病群体和不抗病群体两个基础群体；3)、牙鲆抗病相关MHC基因标记的筛选：对42个抗病个体和42个感病个体的411个MHCIIB克隆进行了测序，发现了13种不同的核苷酸序列，分别编码13种不同的氨基酸序列，命名为13种不同的基因型(Paol-allele*a Paol-allele*m)；411个阳性克隆质粒中的280/268bp的外源序列，去除中间的内含子序列，共编码61个氨基酸，通过与人类MHCIIB的氨基酸序列比对，确定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸区段对应位点为22～82，其中抗原结合位点分别为第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位；在总的编码区内，多态性位点13个，其中多肽结合位点为6个，占多态位点的46.15％；在13种不同的氨基酸序列(Paol-allele*a-Paol-allele*m)中，Paol-allele*a-Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m是抗病群体和感病群体所共有的；即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同时出现于抗病群体和不抗病群体，基因型g和h只出现在抗病群体中，而基因型l只出现在感病群体中；不同等位基因在抗病群体和感病群体中的分布。因此，基因型g和h被认为是抗病相关的MHC基因标记，而基因型l则被认为可能是疾病敏感相关的MHC基因标记。