[发明专利]一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因无效
申请号: | 200510046414.9 | 申请日: | 2005-05-13 |
公开(公告)号: | CN1861799A | 公开(公告)日: | 2006-11-15 |
发明(设计)人: | 吴文芳;安迎锋;吕安国 | 申请(专利权)人: | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
主分类号: | C12P19/34 | 分类号: | C12P19/34 |
代理公司: | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 | 代理人: | 许宗富;周秀梅 |
地址: | 110016辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | 本发明涉及基因定点突变的方法,具体的说是一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因,本方法分为如下步骤:片段合成;双混合;预延伸;全长DNA合成;后延伸。以来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1为起始基因验证了该方法的有效性,并获得了经稀有密码子改造的突变基因,该基因编码的SAM合成酶能在酿酒酵母中高效表达,并且能提高胞内SAM的积累量。本发明在原有重叠延伸PCR的基础上,进行了一系列重要的改进,使得在一个反应过程中实现多点定位突变。 | ||
搜索关键词: | 一种 改进 重叠 延伸 pcr 方法 及其 获得 突变 基因 | ||
【主权项】:
1.一种改进的重叠延伸PCR方法,其特征在于:反应过程分为以下几个步骤:(1)片段合成:以所需突变的全长基因为模板,根据突变位点的个数设计一系列平行引物,引物中包含待突变的碱基,每相邻一对引物的末端设计一个重叠区段,长度为20-30bp;采用上述每相邻的一对引物分别进行平行的PCR,实现各个DNA小片段的扩增;(2)双混合:分别纯化上述片段,分成不同组分,将等量相邻的DNA片段分别两两混合,片段之间互为模板,以重叠延伸PCR方式扩增成长片段,反应为无引物PCR过程;(3)预延伸:将上述多组反应后产物混合在一起,新形成的长片段之间互为模板,以重叠延伸PCR方式扩增成全长新模板,该步骤也是无引物PCR过程;(4)全长DNA合成:在上述反应体系中加入全长基因的一对外侧引物,以上一步产生的重组全长DNA为模板,PCR扩增出全长基因;(5)后延伸:将上述反应体系再经过10个循环的94℃变性30s,72℃退火和延伸1min。
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