[发明专利]一种松树萎蔫病病原线虫的快速的检测方法

摘要

本发明属于森林病害检测技术领域，涉及一种松材线虫和拟松材线虫的检测方法。本发明的技术方案包括四个步骤：①设计用于松材线虫和拟松材线虫PCR检测的特异引物各一对；②用机械破碎和滤纸吸附的方法获得单条线虫DNA作为模板；③进行松材线虫和拟松材线虫的特异PCR扩增；④PCR产物检测。本发明可快速、准确、灵敏地从线虫分离液中鉴定出松材线虫或拟松材线虫，为危险性的松树线虫萎蔫病的诊断及检疫提供了一种快速、准确且便于操作的方法，本发明可用于松材线虫及拟松材的成虫和幼虫。

主权项

1.一种松树萎蔫病病原线虫的快速检测方法，包括以下步骤：(1)根据松材线虫的rDNA序列设计用于松材线虫PCR检测的一对引物：BX1：5’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’BX2：5’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’根据拟松材线虫的rDNA序列设计用于拟松材线虫PCR检测的一对引物：BM1：5’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’BM2：5’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’(2)用于PCR检测的单条线虫DNA模板制备：在解剖镜下从线虫分离液中挑取一条线虫入预先滴在载玻片的双蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待线虫虫体周围的水接近完全干燥时，用镊子取一块预先滴有2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特异引物BX1、BX2、BM1和BM2的线虫检测试剂并已干燥的滤纸片覆盖于线虫虫体上，镊子轻按滤纸片将线虫压破，将滤纸片移入装有15μl双蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加热10min，冷却至室温，8000rpm离心30s得到单条线虫DNA模板制备液(3)PCR扩增：在步骤(2)得到的单条线虫DNA模板制备液中加入2.5μl含1.5～2.0mM MgCl2的10×PCR buffer，1U Taq酶，补双蒸水至25μl；置于PCR仪内进行扩增(4)PCR产物检测：取5～10μl步骤(3)得到的PCR扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶在电泳结束经溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，如检测到一条分子量为501bp的电泳谱带表明受检线虫为松材线虫，如检测到一条分子量为160bp的电泳谱带表明受检线虫为拟松材线虫。