[发明专利]烟草丛顶病毒检测方法

摘要

本发明提供一种烟草丛顶病毒检测方法，属植物保护领域。根据烟草丛顶病毒核苷酸序列设计特异性引物TB2F/TB2R，提取总RNA后采用RT－PCR的方法，直接检测烟草丛顶病毒。本发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术以及总核酸提取法的缺点，方便、特异、灵敏的检测烟草丛顶病毒。

主权项

1、一种检测烟草丛顶病毒的方法，它包括以下步骤：(1)引物设计设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，扩增的目的核酸带大小为550bp，引物序列如下： TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′ TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′(2)总RNA提取：①称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；②在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；③12,000rpm离心10min；④上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；⑤12,000rpm离心10min；⑥弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；⑦沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；(3)RT-PCR扩增①反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板2μL，加入引物TB2R 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入以下试剂： 试剂名称 浓度 用量 5×AMV BUFFER dNTPs RNase Inhibitor AMV Reverse Transcriptase 10mM/dNTP 40u/μL 5u/μL 4μL 2μL 0.5μL 1μL轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；②PCR扩增：在PCR管中加入以下试剂： 试剂名称 浓度 用量 10×PCR Buffer dNTPs MgCl2 TB2R TB2F cDNA产物 Tag DNA polymerase dd H2O 10mM/dNTP 25mM 20μmol/L 20μmol/L 5u/μL 5μL 1μL 3μL 1μL 1μL 2μL 0.5μL 36.5μL 轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、52-58℃退火1min、72℃延伸2min，共31-39次循环，最后72℃延伸10min；(4)电泳检测：取5μL PCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.Sμg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带。