[发明专利]胡萝卜黑腐病的PCR检测及鉴定优化方法

摘要

本发明用于检测及鉴定胡萝卜黑腐病菌的PCR方法，适用于检测胡萝卜黑腐病和早期诊断，准确鉴定引起该病的病原(Alternaria radicina)。属于农作物病害防治领域。该方法根据胡萝卜黑腐病菌的特异性引物检测胡萝卜黑腐病菌，扩增产物大小为343bp。同时，本方法对PCR的扩增程序进行了优化，增加了94℃预变性4min，提高了检测的灵敏性。是对胡萝卜黑腐病菌特异性引物检测方法的补充和改进。

主权项

1、一种胡萝卜黑腐病的PCR检测及鉴定优化方法，包括以下步骤：1)胡萝卜黑腐病菌菌株分离胡萝卜病样取病健交界处1×0.5cm，用70％酒精浸泡30秒，0.1％升汞3分钟，再用灭菌水漂洗三次，每次3分钟，凉干，在PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基25℃培养7天；2)胡萝卜黑腐病病菌基因组DNA提取采用CTAB法进行；3)胡萝卜黑腐病病菌的PCR检测中使用的特异性引物：ARF2 5-AAT CAG CGT CAG TAA ACA AAC G-3ARR3 5-AGA GGC TTT GTG GAT GCT G-34)PCR的反应体系：10×PCR buffer，1.5mM MgCl2，每个dNTP200um，每个引物1.5um，1.5单位聚合酶，10-100ngDNA模板，ddH2O加至25μL反应体积；5)PCR的扩增程序：94℃预变性4min，PCR反应条件按每循环94℃变性2min，70℃40sec退火，72℃1min，扩增共进行35个循环，最后72℃延伸5min；6)取5μL扩增产物于3％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，脱色，置于UPV紫外成像系统上观察，根据343bp扩增产物的有无来判定结果。