[发明专利]检测李坏死环斑病毒的方法

摘要

本发明提供了一种免疫捕获反转录PCR检测李坏死环斑病毒(PNRSV)的方法，属植物保护领域。其方案是，通过抗体特异捕获抗原、RT－PCR以及电泳检测等步骤，对植物中感染的李坏死环斑病毒进行扩增，并通过凝胶电泳进行分离和检测。该方法除了具有普通RT－PCR所具有的快速、特异的优点外，主要是实现了血清学与分子生物学技术的结合，先通过病毒抗体对抗原病毒的特异吸附，将植物中低浓度的病毒进行富集，再通过PCR进行扩增，从而使检测的灵敏度和特异性得到极大的提高，并降低了病毒的漏检率。

主权项

1、一种检测李坏死环斑病毒的方法，其步骤如下：1)设计引物：设计检测李坏死环斑病毒的引物： 引物名称 引物序列 扩增片段大小 PNRSV-F PNRSV-R 5-GTGAAGACCACTTGGACCG-3 5-GGTCCTCATCGACCAGCA-3 483bp2)免疫捕获：(a)取100mg感病组织，加1mL研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入1.5mL离心管中，4000rpm离心4min，上清液即为病组织粗汁液；(b)0.5mL PCR管中加入150μL以包被缓冲液稀释200倍的李坏死环斑病毒抗血清，37℃孵育3h或4℃过夜；(c)弃去包被液，用PBST洗涤3次，加入150μL粗汁液，37℃下孵育3h或4℃过夜；(d)用PBST洗涤PCR管3次，ddH2O洗涤1次，低速离心15sec，弃残余液体；3)RT-PCR：(a)在包被过的PCR管中加入下游引物PNRSV-R1μL，9.5μL ddH2O，轻微振荡混匀后于70℃温育10min，之后迅速冰浴5min；(b)反转录：向上述PCR管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA； 试剂 体积 AMV Buffer dNTPs(10mmol/L) AMV(5u/μL) RNase Inhibitor(40u/μL) 4μL 1.5μL 1μL 0.5μL(c)PCR：取一新的PCR管，按下表体系加入各试剂： 试剂 体积 ddH2O 10×PCR Buffer MgCl2(25mmol/L) dNTPs(10mmol/L) PNRSV-F(20μmol/L) PNRSV-R(20μmol/L) cDNA Taq酶(5u/μL) 33.5μL 5μL 3μL 1μL 1μL 1μL 5μL 0.5μL 总体积 50μL设置PCR程序为：94℃4min，94℃1min、50℃～56℃1min、72℃2min，扩增30～38个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测：配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)结果分析：根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的植物中是否感染李坏死环斑病毒，即如果凝胶中存在483bp的核酸片段则说明样品中含有李坏死环斑病毒。