[发明专利]以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法

摘要

本发明公开了一种生物多肽的制备方法，特别涉及以基因串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法。包括合成两条多聚核苷酸片断、合成片断的连接、扩增、质粒的双酶切、Tα1基因的三次串连、高效表达重组子的构建、工程菌的构建、Tα1多肽六串体在工程菌中的表达、Tα1多肽六串体的纯化和裂解等步骤。本发明应用人工合成的方法，按照大肠杆菌惯用密码子合成Tα1的基因序列，并采用六串体的方法表达，表达产物以包涵体的形式存在于菌内，从而大量表达目的蛋白；工艺简单、操作简便、成本低廉，还能恢复Tα1的天然组成，不影响其生物活性。

主权项

1、一种以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将天然人胸腺素α1所包含的28个氨基酸按照大肠杆菌的惯用密码子，翻译成如下序列：TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACAGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCTTCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性内切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性内切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所对应的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性内切酶Bgl II、终止子、核酸限制性内切酶Xho I所对应的核苷酸；(3)两片断经退火、延伸得到如下一段基因片断：GTC GAC ATG GGA TCC AAT GGG --84bp-GGC AGA TCT TGA CTC GAG Val Asp Met Gly Ser Asn Gly Tα1 Gly Arg SerStop Leu GluHind III BamH I Bgl II Xho I将该片断克隆入pUCm-T中，测序鉴定证明无误后，扩大培养；(4)提取质粒分为两份，BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片段用T4 ligase连接为Tα1二串体；(5)将该二串体克隆扩大培养，提取质粒分为两份，用BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片段用T4 ligase连接为Tα1四串体；(6)提取二串体质粒，用BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；提取四串体质粒，用Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片断用T4 ligase连接为Tα1六串体；(7)将天然胸腺素α1六串体克隆在质粒pET22-b(+)的核酸限制性内切酶Hind III、Xho I位点之间，经酶切、测序鉴定无误，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下以包涵体形式表达；(8)分离纯化包涵体得到Tα1六串体蛋白，于25～45℃、pH4.5～7.0条件下，经0.2～2.0M的羟胺裂解48～72h，得到天然人胸腺素α。