[发明专利]无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术

摘要

本发明公开了一种无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，涉及无色孔雀石绿在生物体内的快速检测。由于无色孔雀石绿无与蛋白偶联的基团，无法用竞争性酶联免疫法(ELISA)批量检测，为了快速检测孔雀石绿在水产品体内残留，本发明先合成硝基无色孔雀石绿并还原，纯化，获氨基无色孔雀石绿，再与兔白蛋白偶联成无色孔雀石绿完全抗原；用其免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0进行了细胞的融合，采用二步法进行阳性克隆的筛选，经过多次的亚克隆，获得稳定分泌抗无色孔雀石绿的单克隆抗体。

主权项

1、无色孔雀石绿完全抗原与单克隆抗体制备技术，其特征在于所述无色孔雀石绿完全抗原的制备过程包括下述步骤：A、以N、N二甲基苯胺为原料，按1∶3～4摩尔量比加入对硝基甲醛，合成硝基无色孔雀石绿；B、硝基孔雀石绿按摩尔量比加入10倍左右量的稀HCl、5～8倍的金属粉末，还原为氨基无色孔雀石绿；C、将氨基无色孔雀石绿溶液滴加于碱溶液中，析出沉淀，沉淀物为纯化的氨基无色孔雀石绿；D、按每100mL纯化的氨基孔雀石绿溶解于6ml 0.3mol/L HCl的比例，将纯化的氨基孔雀石绿搅拌溶解，然后在冰浴搅拌条件下缓慢加入1％NaNO2，使氨基孔雀石绿重氮化，取淀粉/碘化钾溶液滴于白色干燥波片，滴加一滴上述重氮化溶液，混合后30秒内呈现蓝黑色，即为完成氨基孔雀石绿的重氮化；E、上述重氮化的氨基孔雀石绿继续反应20分钟，称取4倍于氨基无色孔雀石绿重量的兔白蛋白，溶于碳酸盐缓冲液成2％蛋白溶液，在冰浴搅拌条件下缓慢加入重氮化的氨基无色孔雀石绿溶液，边加边用0.01mol/L NaOH调节pH至7.5～8.0，获氨基无色孔雀石绿与兔白蛋白的偶联物(NLMG-RSA)，置4℃冰箱中过夜后，于4℃条件下用0.1mol/L pH7.2的PBS透析三天，每天换透析液三次，分装、冻干后，-20℃保存。