[发明专利]靶向抗肺癌SOD的构建与表达的方法

摘要

本发明公开了一种pET－SOD工程菌的构建及其表达纯化方法，本发明通过下述技术方案予以实现：设计引物从含念珠藻CHEN Fe－SOD的pET－SOD质粒中扩增获得Fe－SOD基因；设计引物从含ScFv的T－ScFv质粒扩增获得ScFv基因；酶切Fe－SOD基因和ScFv基因后重组得到SOD－ScFv融合基因，并重组进pET28a(+)质粒载体，构建得到Pet－SOD－ScFv融合载体，转化至感受态大肠杆菌BL21，得到Pet－SOD－ScFv工程菌；加入IPTG和Fe³⁺诱导，SOD－ScFv获得表达。利用本发明，SOD－ScFv获得高效表达，提高了SOD对肿瘤细胞的识别、定位和透膜能力。

主权项

1、一种抗肺癌SOD的构建的方法，其特征在于依次包括以下步骤：(1)从含念珠藻CHEN Fe-SOD(Nostoc commune strain CHEN Fe-SOD)的pET-SOD质粒中TD-PCR扩增获得Fe-SOD基因；TD-PCR扩增所用引物：SOD-Nco：5’-CATGCCATGGCATTTGTACAGCTCCCACTACCCTTTG含Nco I位点，SOD-Sal：5’-GCGTCGACTCCGCCTCCACCAGCTTTGGCCAAGTTTTC含Sal I位点，引物SOD-Sal去除Fe-SOD基因序列3’端的TAA终止密码子，并在其末端加上编码GGGG的密码子，即：GGCGGAGGCGGA；(2)以含ScFv的T-ScFv质粒为模板TD-PCR扩增获得ScFv基因；TD-PCR扩增所用引物：ScFv-Sal：5’-ACGCGTCGACGTCCAACTGCAGGAGTCAGG含Sal I位点，ScFv-Not：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATTTGATCTCGAGCTTGGTC含Not I位点；引物ScFv-Not末端含TAG终止密码子；(3)以Nco I，Sal I酶切步骤(1)得到的Fe-SOD基因；(4)以Sal I，Not I酶切步骤(2)得到的ScFv基因；(5)将步骤(3)和(4)得到的基因重组得到SOD-ScFv融合基因，并重组进经Nco I，Not I酶切的pET28a(+)质粒载体，控制此融合基因5’端与T7启动子之间的距离，构建得到Pet-SOD-ScFv融合载体；(6)将Pet-SOD-ScFv融合载体转化至感受态大肠杆菌BL21，命名为Pet-SOD-ScFv工程菌。