[发明专利]梨树病毒一步RT－PCR检测试剂盒及其检测方法

摘要

梨树病毒一步RT－PCR检测试剂盒及其检测方法，本发明涉及梨树上潜隐的梨环纹花叶、苹果茎沟、梨脉黄三种病毒的一步RT－PCR检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒，包括、引物、十二烷基磺酸钠、研磨缓冲液、反转录酶、聚合酶、上游引物、下游引物，RT－PCR检测试剂盒制作方法简便，易于产业化生产，针对RT－PCR检测试剂盒所提供的检测方法检测梨树的梨环纹花叶病毒、苹果茎沟病毒、梨脉黄病毒的灵敏度高、重复性好、可操作性强、简单易行、检测成本相对较低。

主权项

1、一种用于梨树病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括，上游引物：梨环纹花叶病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，苹果茎沟病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脉黄病毒 5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物：梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，苹果茎沟病毒 5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脉黄病毒 5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT---3′，上述上游引物、下游引物的浓度为0.0009mmol/L；1#液；研磨缓冲液：含有6000mmol/L盐酸胍、200mmol/L醋酸钠、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液；含有10％十二烷基硫酸纳，30mL，3#液；含有6000mmol/L碘化钠溶液，10mL，4#液；含有乙醇，5mL，5#液；含有1000mg/mL硅粉悬液0.75mL，6#液；含有洗涤锾冲液：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化钠、50％乙醇，30mL，7#液；含有TE：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液；含有RT-PCR锾冲液：病毒特异引物各0.0009mmol/L、四种碱基混合物各0.0.75mmol/L、10×Tag酶缓冲液、氯化镁2mmol/L，0.3mL，9#液；含有鼠白血病病毒反转录酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反转录酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL，10#液；含有无菌去离子水，1mL，11#液；含有病毒阳性对照(CK+)，0.1mL，12#液；含有病毒阴性对照(CK-)，0.1mL。