[发明专利]应用RNA酶保护法高通量筛选天然存在的正义－反义转录物

摘要

本发明涉及一种高通量筛选天然存在的正义－反义转录物(Naturalsense－antisense transcripts，NSATs)的新方法。本发明利用细胞内NSATs是双链RNA分子的特点，以及双链RNA分子能够免受单链RNA特异的RNase I的酶解作用，从而在RNase I酶解反应中保留下来的特性，建立了通过实验的手段来实现高通量筛选细胞内真正的NSATs的方法。利用这一方法，可以通过高通量筛选各种来源和状态的组织或细胞内真正的正义RNA－反义RNA复合物，理论上，通过该方法可以获得细胞内任何一个存在的NSATs。在鉴定RNA作用的靶向基因或筛选潜在的RNA药物时，本发明也有重要的应用价值。

主权项

1.本发明涉及一种高通量筛选细胞内真正的正义-反义转录物的新方法，实施步骤为：i. 提取组织总RNA。ii. 用RNaseI处理总RNA。iii. 证实残余的RNA是双链RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)。iv. 证实残余的RNA是细胞内源的RNA。v. 把双链RNA变性为单链RNA。vi. 把单链RNA逆转录为互补的DNA(Complement DNA，cDNA)。vii. 在cDNA的3’端加上多聚A。viii. 合成cDNA的第二条链。ix. 制备双链DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)的一个平端和一个粘端。x. 把双链DNA克隆入克隆载体。xi. 把重组载体转化如宿主细胞，构建总RNA中NSATs的cDNA文库。xii. 对克隆进行序列测定。xiii. 把克隆序列进行生物信息学分析。