[发明专利]用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法

摘要

本发明用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法涉及的是一种关于应用细胞工程技术制备成纤维细胞的一种方法，产生的成纤维细胞可用于细胞移植。属于生物细胞工程技术领域。用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞，制备自体成纤维细胞的方法：从9mm³－21mm³小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到4×10⁷－8×10⁷个，所制备的细胞为传代次数不超过5次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞。制备的自体成纤维细胞可以供治疗女性尿失禁和消除皱纹及凹陷性疤痕的细胞移植之用。移植到尿道周围组织、皱纹和疤痕处的皮肤真皮层内后，在人体内是一种自然生理性的修复，不会产生免疫排斥等副作用。

主权项

1、一种用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，其特征在于用细胞工程技术分离和纯化皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法：从9mm3-21mm3小块皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，纯化后培养成纤维前体细胞使其分化为成纤维细胞、并增殖到4×107-8×107个，所制备的细胞为传代次数不超过5次，处于功能活跃期的成熟成纤维细胞，制备细胞的方法由以下步骤组成：(1)无菌条件下，获取受术者9mm3-21mm3小块皮肤组织；(2)采用机械解离细胞法从皮肤组织中分离出成纤维前体细胞，并进行植块培养，步骤如下：1)首先将经修整和冲洗过的组织块放人小烧杯中，用眼科剪反复剪切组织至似糊状；2)加入3ml培养液到烧杯中，反复轻轻吹打片刻，离心800～1200r/min，3～5min，去上清，剩下的组织小块用于培养；3)用湿润的吸管小心吸取组织小块，轻轻吹到培养瓶内；4)用玻棒将植块排列好；5)加入少量基础培养液，以不使植块浮出为准；6)送入CO2培养箱内，静置；7)在2～4天内加入足够的基础培养液，继续培养；(3)采用差速脱壁处理方法纯化成纤维前体细胞，并进行传代，步骤如下：1)吸去旧培养液；2)用PBS溶液轻缓漂洗培养物2～4次，尽量洗去残余血清，弃PBS溶液；3)给培养器皿内加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃条件下消化3～5min；4)以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化；5)用弯头吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；6)离心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液；7)用基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度至1-2×103个/ml；8)接种在1-2个新的培养瓶内；9)送人培养箱中继续培养； (4)使用特制的培养液促使成纤维前体细胞分化为成纤维细胞并大量增殖； (5)对培养的细胞进行鉴定，在成熟的成纤维细胞培养瓶内加入3-5ml的0.25％胰蛋白酶溶液于35～38℃条件下消化3～6min，以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化，用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶底壁，使已经消化的细胞脱离培养瓶底壁，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清含酶溶液，加入生理盐水5ml，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，再加入生理盐水5ml，离心800～1200r/min，3～5min，除去上清液，将细胞沉淀用生理盐水悬浮，细胞浓度为1×107个/ml，即制成自体成纤维细胞悬浮液。