[发明专利]大菱鲆抗菌肽基因及其酵母表达载体

摘要

一种大菱鲆抗菌肽hepcidin基因及其酵母表达载体，它的方法是分离克隆了大菱鲆抗菌肽cDNA及基因组基因，将该基因成熟肽序列重组到酵母胞内表达载体pGAPZB上，构建成融合型表达载体pGAPZB－thep6his，转化毕赤酵母SMD1168，获得了能够稳定表达融合型抗菌肽蛋白的酵母菌株；通过SDS－PAGE和Western blot检测认为抗菌肽基因实现了表达.。本发明首次克隆了大菱鲆抗菌肽基因并构建了胞内融合型酵母表达载体，实现了胞内融合型表达重组大菱鲆抗菌肽，不需要对重组抗菌肽进行分离纯化，可直接以酵母菌的形式作为鱼类等水产动物的饲料添加剂。本发明方法可用于各种鱼类抗菌肽基因克隆和表达载体的构建，用于鱼类等水产动物的疾病防治。

主权项

1、一种大菱鲆抗菌肽hepcidin基因，其特征在于大菱鲆抗菌肽基因的克隆，主要包括全长cDNA、基因组DNA的获得，序列分析与比对；cDNA的克隆：用TRIzol试剂盒从大菱鲆肝脏中提取总RNA，用MMLV反转录为cDNA的第一条链；根据不同物种的hepcidin的氨基酸序列的同源区域设计简并引物，扩增得到hepcidin基因的cDNA全长编码框；基因组DNA的获得：用一对来自于cDNA的特异性引物扩增大菱鲆基因组DNA，得到包含有内含子的hepcidin基因全序列；DNA序列分析与比对：将从cDNA序列与GENBANK序列数据库中已存的hepcidin基因的序列进行比对，用PHRAP聚类程序鉴定共同序列和单一序列；用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA与GENBANK序列数据库中已存的hepcidin基因序列的同源性。