[发明专利]人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂的制备方法及应用

摘要

本发明公开了人体免疫活性细胞(DCCIK)抗肿瘤细胞制剂及制备方法。该方法用有关细胞因子对取自患者外周血分别诱导成DC与CIK，在应用α－Galcer或CI对DC反复冲击后与CIK细胞按比例作混合共培养，即获DCCIK细胞。与同源CIK比较，其增殖活性和细胞毒活性均有较大提高。该DCCIK为未经相关肿瘤抗原冲击而对同源肿瘤具有特异靶向和高效广谱杀瘤作用。可有效防止肿瘤术后和放化疗后的转移和复发。在与其他疗法配合下，可延长患者生存期并改善生活质量。

主权项

1、一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂，其特征在于该制剂是通过下列方法制得的，(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血，用生理盐水对倍稀释后，用淋巴细胞分离液Ficoll，1.077，离心2000rpm×25’，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×106/ml细胞悬液；(2)非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培养2-6h，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞就留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ 1000U/ml AIM-V培养液的25cm2 培养瓶，100ml/瓶，置37℃，5％CO2培箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm2培养瓶，同时加入终浓度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/mlAIM-V继续培养48-72h，镜下计数，用CIK培养液调细胞密度为4×105/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，培养至第5-7天即收集CIK细胞备用；抗CD3单抗包被方法：在AIM-V培液中加入抗CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5～10μg/ml的包被液，在25cm2培瓶中加入5ml包被液，4℃过夜或者37℃温育2h后，弃去全部包被液即可；(4)粘附DC细胞的诱导和扩增在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml内含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培养2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，连续刺激3天后，于第5-7天收集细胞备用；(5)DC与CIK 1∶5混合共培养制取DCCIK细胞取培养至第5-7天之DC和CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用AIM-V无血清培液调两细胞的密度分别为2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等体积混合后移入25cm2培养瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培养，每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后即可获5×109～1×1010的DCCIK细胞；(6)DCCIK细胞制剂离心收集1～5×109细胞，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液制剂。