[发明专利]一种消除皮肤皱纹生物制剂的配制

摘要

本发明涉及一种消除人体皮肤皱纹的生物制剂的配方和制备。包括现行的自体胶原蛋白形成细胞的制备方法及与肉毒毒素A的联合应用，属于组织工程领域。本发明采用胰酶消化法成功的从成年人体表皮肤中分离获得了纯净的胶原蛋白形成细胞并规模化培养至上千万个活性胶原形成细胞，可供皮肤美容除皱、疤痕修复、皮肤组织填充、皮肤损伤后修复及烧伤后人工复合皮肤的制备及其它目的所需。本发明采用上述自体细胞与商品化的肉毒毒素A联合配伍，配成新的美容除皱的针剂可以用于人体表皮肤皱纹尤其是动力性皱纹的治疗。最终效果自然、持久无严重副作用。

主权项

1、一种消除皮肤皱纹生物制剂的配制，其特征在于以下步骤：(1)首先采用无菌技术从耳后或前臂内侧皮肤细嫩处取一块约0.5cm宽，2cm长的皮肤，放入特制的保存液(100u/ml青、链霉素的M199培养液)中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(通常8小时内)送交专业实验室分离。(2)将上述皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织和脂肪；然后用含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液洗液(pH7.40.01M PBS)漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发。(3)将处理后的皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的pH7-9Hank’s液配制的0.1-1％的胰酶4-16C消化6-24小时。(4)轻吸弃消化液，加入预冷的2ml含10％胎牛血清的M199培养液，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新的培养孔，37C，5％CO2，(SANYO公司)静置培养。(5)培养3-7天，待胶原蛋白形成细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.40.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液，37C，消化10分钟。吸弃消化液，换7ml生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶(Nunc公司)，37℃，5％CO2，继续静置培养。(6)视情况3-4天换液一次，一周传代，每瓶传2-3瓶。(7)待细胞总数扩至108，0.85％的生理盐水漂洗1次后，再加入2～5ml消化液，37C，消化10分钟，吸弃消化液，0.85％的生理盐水吹打重悬并离心漂洗4次，最终重悬于2-4ml生理盐水中备用。