[发明专利]在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法以及工程菌无效
| 申请号： | 200510115661.X | 申请日： | 2005-11-09 |
| 公开（公告）号： | CN1962862A | 公开（公告）日： | 2007-05-16 |
| 发明（设计）人： | 梁国栋;付士红;葛涛 | 申请（专利权）人： | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 |
| 主分类号： | C12N15/09 | 分类号： | C12N15/09;C12N1/19;C12N9/68;C12N15/58;A61K38/49;A61P7/02;C12R1/84 |
| 代理公司： | 北京北新智诚知识产权代理有限公司 | 代理人： | 郭佩兰 |
| 地址： | 100052*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法以及工程菌，方法包括：通过化学合成方法或应用PCR技术扩增DNA/RDA方法获得蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列；含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建；线性化重组质粒电穿孔转化感受态酵母细胞；双层滤膜法筛选高表达株，并放大培养；PI239蛋白在酵母中以α－factor信号肽蛋白引导的分泌表达；以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239及纯化。工程菌为pPICPI239/KM71－48，保藏号为：CGMCCNo1515。优点：本发明克隆到蚯蚓纤溶酶PI239基因，并成功地进行了表达，为今后开发研究基因工程产品创造了良好的条件，且本发明的蚯蚓纤浴酶PI239为治疗血栓栓塞性疾病等药物提供新的蛋白。 | ||
| 搜索关键词： | 酵母 系统 高密度 发酵 生产 重组 蚯蚓 纤溶酶 pi239 方法 以及 工程 | ||
【主权项】：
1、一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)、通过化学合成方法或应用PCR技术扩增DNA/RDA方法获得蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列；(2)、含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建：表达载体为T7；(3)将重组质粒大量提取和纯化；(4)、酵母感受态细胞的制备；(5)、线性化重组质粒电穿孔转化感受态酵母细胞；(6)、双层滤膜法筛选高表达株，并放大培养；(7)、阳性克隆的诱导表达及筛选：PI239蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导的分泌表达；(8)、以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239；(9)、重组蚯蚓纤溶酶PI239纯化。
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