[发明专利]新疆雪莲细胞组织培养物及其大规模继代培养的方法

摘要

本发明公开了一种大规模培养新疆雪莲细胞组织的方法，该方法为：以MS基本培养基附加一定量的NAA(萘乙酸)、6－BA(6－卞氨基嘌呤)为雪莲愈伤组织的培养基质；新疆雪莲种子经过培养诱导出雪莲植株；该植株作为外植体，在特定条件下进行脱分化处理，诱导愈伤组织；按工艺要求选取愈伤组织进行周期性的继代培养，使愈伤组织增殖，该愈伤组织一部分作用种子，其它收集干燥即为雪莲培养物；按质量要求收集雪莲培养物并进行干燥处理，即得本发明新疆雪莲细胞组织培养物。该方法不仅能明显提高新疆雪莲细胞培养物中有效成份的含量，而且有利于达到产业化水平。

主权项

1、一种新疆雪莲细胞组织培养物，其特征在于该培养物是经如下步骤得到的：I、植株诱导：分别称取硝酸钾190重量份、硝酸铵165重量份、硫酸镁37重量份、磷酸二氢钾17重量份、氯化钙44重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，加水至5000体积份，混合均匀，得MS培养基母液A，4℃保存备用；分别称取硫酸锰6.76重量份、硫酸锌3.44重量份、硼酸2.48重量份、碘化钾0.332重量份、钼酸钠0.1重量份、硫酸铜0.00005重量份、氯化钴0.00005重量份，分别加水200体积份，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，加水至2000体积份，混合均匀，得MS培养基母液B，4℃保存备用；分别称取EDTA-2Na7.45重量份、硫酸亚铁5.57重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将2种溶液混匀，加热，加水至2000体积份，得MS培养基母液C，4℃保存备用；称取甘氨酸0.4重量份、盐酸硫胺素0.08重量份、盐酸吡哆素0.1重量份、烟酸0.1重量份、肌醇20重量份，加水1000体积份，并加热至完全溶解，加水至1000体积份，混合均匀，得MS培养基母液D，4℃保存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入MS培养基母液A100体积份、MS培养基母液B10体积份、MS培养基母液C20体积份、MS培养基母液D10体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份搅拌后，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得植株诱导MS培养基；分装；灭菌；备用；将保藏的新疆雪莲种子用70～75％酒精浸泡25～30分钟，再用0.1～0.15％的升汞摇晃灭菌10分种，最后用无菌水洗4～6次；将灭菌彻底的种子于无菌条件下接种在配好的植株诱导MS培养基上，每25ml培养基中接种8～15粒种子；在25℃，连续光照的条件下培养10天，出芽后，培养成雪莲植株；II、诱导愈伤组织：按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000体积份、MS培养基母液B2000体积份、MS培养基母液C2000体积份、MS培养基母液D1000体积份，4℃保存备用；取0.15～0.25重量份2，4-D，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至1000体积份，摇匀，得2，4-D母液，4℃保存备用；取0.05～0.15重量份6-BA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至500体积份，摇匀，得6-BA母液，4℃保存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入上述MS培养基母液A200体积份、MS培养基母液B20体积份、MS培养基母液C40体积份、MS培养基母液D20体积份、2，4-D母液20体积份、6-BA母液4体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份，搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得诱导愈伤组织MS培养基；分装；灭菌；备用；雪莲植株继续培养至5～8cm，选取生长良好的雪莲植株作为外植体；将外植体接种于诱导愈伤组织MS培养基上，每25ml培养基中接种6～10块直径为0.5cm的外植体，暗培养5～10天；诱导产生愈伤组织，愈伤组织在光照条件下培养，光照条件为8-12小时/天，白光，温度为22℃～28℃；III、培养物继代培养：按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4℃保存备用；取1.5～2.5重量份NAA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，移入加水至10000体积份，摇匀，备用，得NAA母液，4℃保存备用；取0.5～1.5重量份6-BA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至5000体积份，摇匀，备用，得6-BA母液，4℃保存备用；称取蔗糖1200重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A2000体积份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、NAA母液600体积份、6-BA母液40体积份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌；备用；筛选高产细胞系，选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，愈伤组织的培养条件为：15重量份的愈伤组织种子需要在1000体积份的继代培养MS培养基培养，培养周期为15～20天，培养温度为20～30℃；至培养期，选取生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的愈伤组织作为种子，种子量为生产量的15％，其他收集并低温真空干燥即为雪莲细胞组织培养物。