[发明专利]多级放大荧光免疫分析方法

摘要

本发明属于荧光免疫分析技术领域，涉及多级放大荧光免疫分析方法。采用含16碳长链琥珀酰亚胺酯－生物素标记特异及发光蛋白(R－PE)，使R－PE分子与相结合的亲和素(A)之间的空间距离以及R－PE与固相微珠(PSMD)的距离加长，有效的解决了发光基团(R－PE)与多级结合的免疫复合物之间的“空间阻碍”，使R－PE发出的不被相邻的分子及固相材料所熄灭，保证了荧光强度的多级放大。实现了荧光强度10³以上的多级放大，使灵敏度达1pg/ml。可方便的应用于各类免疫分析，如RIA、ELISA、FIA等领域。

主权项

1.多级放大荧光免疫分析方法，其特征在于，步骤和条件如下：I.使用的仪器：●荧光分析仪Luminex Multi-100型；●高速离心机2000rpm；●超声波清洗仪50HZ；●蛋白、核酸监测仪；II.使用的试剂：●羧基化聚苯乙烯(PSMD)中80-100nm Luminex CO产；●硫代琥珀酰亚胺酯，碳二亚胺，生物素，链亲和素，R-藻红蛋白，皆为免疫纯，购自sigma试剂；●HBsAg，抗HBs，羊抗人IgG，免疫纯长春生物制品研究所产；●HCV(丙型肝炎病毒)抗原、HIV(艾滋病毒)抗原、HBe(乙型肝炎-e)抗原，中国医科院病毒所产；●Sephadex G-25、G-100，磷酸盐(PBS)、硼酸盐、碳酸盐等为分析纯；III、步骤和条件由以下4步组成：①.羧基化微珠(PSMD)偶联PcAb配制缓冲液：●活化缓冲液-0.1M(pH6.2)PBS；●偶联缓冲液-0.05M(pH7.4)PBS；●冲洗缓冲液-0.05M(pH7.4)PBS含吐温-20用量为0.1％(v/v)；●贮存缓冲液-0.01M(pH7.2)PBS含0.05％硫柳汞(w/v)，0.05％庆大霉素(v/v)；偶联PcAb方法：●取PSMD1ml(含微珠1.3×107个)，用去离子水及活化缓冲液各冲洗两次；●加偶联活化剂—硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS)和1-乙基-(3-二甲基、氨基、丙基)碳二亚胺(EDC)分别溶于活化缓冲液浓度均为50mg/ml，各取10μl加到PSMD中，室温反应20分钟，用偶联缓冲液冲洗两次；●加入PcAb150μl(蛋白含量15μg)，室温反应3小时，用冲洗缓冲液冲洗三次，之后将偶联抗-HBs的PSMD存放于贮存缓冲液中，4℃保存备用；②.B标记McAb●McAb(MW150,000)溶于0.1MPBS(pH7.2)含0.15M NaCl，浓度为10mg/ml(w/v)；●取水溶性Sulfo-LC-NHS-B((长链硫代琥珀酰亚胺-生物素)溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml(w/v)；取20ml(含8×104mM)加入1mlMcAb溶液中(Sulfo-LC-NHS-B/McAb＝12∶1摩尔比)，室温反应60分钟；●Sephadex-G-25柱层析(用0.01M pH7.2PBS平衡)，取集第一峰，加入0.05％庆大霉素(v/v)于4℃保存；③.B标记藻红蛋白(R-PE)●取0.5mlR-PE(含R-PE1mg)置于透析袋中，透析液为0.05M硼酸盐缓冲液(pH8.5)含0.3M NaCl，三次换液，每次500ml，在4℃放置24小时，取出置于反应管中；●取0.2mg Sulfo-NHS-LC-B(其对R-PE摩尔比为1∶26)直接溶于R-PE中，室温反应90分钟，然后加入中止液0.5ml，中止液为0.075g甘氨酸溶于1ml 0.1M pH7.5的PBS；●Sephadex G-100经0.01M pH7.2PBS平衡后，将反应液过柱，收集第一峰，加0.01％NaN3于4℃保存；④.进行荧光免疫分析HBsAg：试剂准备：稀释液0.01M pH7.2PBS冲洗液：0.01M pH7.2PBS含0.15M NaCl，0.01％吐温-20(v/v)；PcAb联接微珠 1.3×107个/ml；HBsAg 10mg/ml；B-McAb 90mg/ml；A 1mg/ml；B-R-PE 4mg/ml；分析方法：将已配好浓度的PcAb、HBsAb和B-McAb三种溶液混合，加入④中配好的稀释液300μL，室温下温育1-2个小时后，加冲洗液冲洗三次，为悬浮液1；将已配好浓度的A与B-PE溶液混合，加入④中配好的稀释液100μL，室温下温育30-60分钟后，加冲洗液冲洗三次，为溶液2；将悬浮液1和溶液2合并，室温下温育30-60分钟后，再加冲洗液冲洗三次，然后离心分离，分出沉淀物PSMD，对其用稀释液稀释至100μL，最后用荧光分析仪或激光荧光光度计进行测量，从而构成多级放大荧光免疫分析方法。