[发明专利]一种土壤总DNA小量快速提取方法

摘要

本发明公开了一种土壤总DNA的小量快速提取方法。以土壤为材料，采取石英沙、二氧化硅粉末振荡和十六烷基三甲基溴化铵共同裂解细胞释放DNA，释放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高浓度硫氰酸根离子下可被硅藻土吸附，当条件改变后，在弱碱性下DNA又被低盐缓冲液或去离子水洗脱出来，这样提取的DNA具有足够的纯度和量用于PCR和酶切反应。主要步骤包括裂解细胞、抽提DNA和纯化DNA三步。本发明具有简单、快速、方便、提取的DNA纯度高和价格便宜等优点，而且可应用于试剂盒的制作，在半小时左右提取比较纯的土壤总DNA，用于土壤微生物学和分子生物学研究。

主权项

1、一种土壤总DNA的小量快速提取方法，其主要步骤包括：样品制备、PCR和电泳，具体步骤如下：(1)制作裂解管：称取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在80℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，装入2ml的离心管，121℃灭菌30分钟；(2)称取土样0.5克到步骤(1)的裂解管中，加裂解缓冲液1毫升后混匀；(3)用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪上振荡5分钟；(4)在10,000×g下离心1分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的1.5毫升离心管中；(5)在10,000×g下离心2分钟后小心吸取上清液0.4毫升到一洁净的2毫升离心管中，将吸附基质悬浮液摇匀后加1毫升；(6)手动轻轻摇匀2分钟，使DNA与吸附基质充分结合；(7)在10,000×g下离心10秒后小心弃去上清液0.8毫升，将吸附基质重新悬浮后全部吸取，移到含收集管的离心纯化柱上；(8)在10,000×g下离心1分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；(9)在离心纯化柱上加0.5毫升洗涤液，在10,000×g下离心1分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在10,000×g下离心2分钟以除去残留的洗涤液；(10)将离心纯化柱转至一洁净的1.5毫升离心管中，于室温下干燥2分钟；(11)在离心纯化柱中间加100微升TE缓冲液或去离子水，用手指轻弹管壁1分钟以保证DNA的充分洗脱，在10,000×g下离心1分钟收集DNA；(12)以步骤(11)抽取的DNA为模板，以16S rDNA引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’和1492R5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’为引物扩增出土壤16S rDNA并进行电泳检测；(13)用EcoR I和Pst I对步骤(11)提取的DNA作双酶切并进行电泳检测。