[发明专利]酶解提取梨花粉原生质体的方法

摘要

本发明梨花粉和花粉管原生质体的提取方法，涉及植物体细胞壁的破除和原生质体获取的方法，是属于生物化学及食品科学领域；本发明的主要是依据植物花粉细胞壁的特性来获取完整的花粉或花粉管原生质体，而且保持原有的活力。采用两步法获取花粉及花粉管原生质体，步骤主要包括采集成熟花粉，在花粉培养基中培养3～3.5h后，进行酶解反应50min后、离心，就能获得完整的具有活力的花粉粒(管)的原生质体，而且该原生质体仍然保持原有活性，适合于作为花粉及花粉管的生理生化及细胞信号转导特性研究的实验材料。

主权项

1、花粉原生质体的提取方法，包含下列步骤：1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；2)培养基及酶解液的制备：培养基的制备：可以用下列两种培养基的其中一种：(1)蔗糖10％，Ca(NO3)2·4H2O 0.01％，250mM α-磺基甲脂磺酸钠/三(羟甲基)氨基甲烷；pH6.0-6.2；(2)蔗糖15％，Ca(NO3)2·4H2O 0.05％，MgSO4·7H2O 0.02％，KNO3 0.01％，0.01％H3BO3，250mMα-磺基甲脂磺酸钠/三(羟甲基)氨基甲烷；pH6.0-6.2；酶母液的配制：甘露醇0.6mM，KNO3 100mM，KH2PO4 20mM，MgSO4 100mM，CaCl2 100mM，KI 100mM，CuSO4 0.1mM，α-磺基甲脂磺酸钠250mM，Vc0.5mM，pH 5.3(Tris-HCI)；酶液的配制：取100ml的酶母加入1.5％纤维素酶R-10，0.7％果胶酶Y-23，和1％牛血清蛋白，配制好的酶液分装后在-20℃冰冻低温下保存；3)花粉壁的破除过程：(1)花粉的培养：取干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在黑暗、温度25～27℃的条件下培养，时间为3～3.5h；(2)培养后的花粉，用离心机清洗花粉2-3次，1200rpm，清洗液为酶母液；(3)酶解：吸取清洗后的花粉悬浮液100μl，放入900μl的酶液中，开始酶解，温度29～31℃，100rpm，黑暗条件，时间50min；(4)酶解后，用离心机清洗3次，500rpm，清洗液为胞外液，清洗后，沉淀即为原生质体。